以淀粉為原料制備葡萄糖-1-磷酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種憐酸葡萄糖的制備方法，具體設及一種W淀粉為原料制備葡萄 糖-1憐酸的方法。
【背景技術】
[0002] 葡萄糖-1-憐酸（G-1-巧廣泛存在于動植物W及微生物中，在生物體中起著重要 的作用。G-1-P是糖原等多糖降解的第一個產物，可W在葡萄糖憐酸變位酶巧C 5. 4. 2. 2) 的作用下生成葡萄糖-6-憐酸，進入EMP途徑；也可W在核酸二憐酸葡萄糖焦憐酸化酶的 催化下合成核酸二憐酸葡萄糖（NDP-glucose)，進一步用于各種糖巧的合成等。G-1-P在醫 藥、食品方面應用廣泛，它能明顯阻止脂肪肝浸潤，促進骨骼及牙齒中巧的累積，W及增強 巧在哺乳動物小腸內的主動運輸。此外，G-1-P還可W用作抗菌劑，其銷馨合物更可用于癌 癥的治療；殼聚糖/G-1-P即型水凝膠可W作為創面止血材料及藥物緩釋材料。
[0003] 用于生產G-1-P的葡聚糖憐酸化酶可^從±豆中提取，W可溶性淀粉為原料 (化tional Academy Science Letters 2013, 36 (2): 133-137)。微生物是葡聚糖憐酸化酶 的最主要來源，微生物產酶具有產量高、易分離等優點。1979年，Werner等人對化ysarum polyce地alum中的a -葡聚糖憐酸化酶進行分離純化并對酶學性質進行表征。該酶為糖原 憐酸化酶，最適溫度為30°C，最適抑為6. 7。在憐酸解方向，G-1-P與鳥巧二憐酸葡萄糖對 反應有抑制作用，而5' -AMP則有微弱的促進作用，可W中和G-1-P的抑制作用巧uropean Journal of Biochemistry. 1979,102:345-355)。1998 年，hkata 等人對嗜熱脂肪芽抱桿 菌中的葡聚糖憐酸化酶進行研究，發現其最適溫度為50°C (Journal of F'ermentation and Bioengineering 1998,85(2) : 156-161)。由于耐高溫酶具有反應速率高、不易染菌、酶穩定 性好等優點，在工業應用中占有極大優勢。2005年，化ngdon等人將化ermus caldophilus 中編碼葡聚糖憐酸化酶的基因進行克隆，在E.coli中表達，將重組葡聚糖憐酸化酶分離 純化，并對酶學性質進行表征。此重組酶的最適抑為7. 0,最適溫度為70°C，在低于70°C 時酶較穩定，而當溫度高于80°C時，酶活迅速下降。W可溶性淀粉為原料，在70°C下生產 G-1-P，底物轉化率達68. 78 %，是目前報道的W葡聚糖憐酸化酶催化制備G-1-P的最高值 (Process Biochemistry 2005,40:3707 - 3713)〇
[0004] 目前所有的葡聚糖憐酸化酶研究中均采用可溶性淀粉為底物，而可溶性淀粉生產 工藝較復雜，價格是普通淀粉的3-4倍，不適合G-1-P的大規模生產。如果能W廉價的普通 淀粉代替可溶性淀粉直接用作酶催化產G-1-P的原料，則有望顯著降低原料成本。目前， 國內外未見有關普通淀粉制備G-1-P的報道，主要原因可能是普通淀粉在常溫下不能完全 糊化，很難直接利用。而目前已報道的用于合成G-1-P的葡聚糖憐酸化酶中，最高溫度為 70°C。一般而言，常見淀粉的糊化溫度為60-70°C，完全糊化溫度為65-75°C，若反應溫度為 70°C，不能保證淀粉完全糊化。且70°C時各淀粉的粘度較高，如5%玉米淀粉及馬鈴馨淀粉 粘度分別為420CP及880CP。在70°C下反應，則造成底物與酶接觸不充分，不利于反應進行。 所W若要有效地利用淀粉，需要尋找一種反應溫度更高的酶，使淀粉完全糊化，體系粘度降 低。
【發明內容】
陽〇化]本發明的目的是針對G-1-P現有的生產原料價格昂貴的問題，提供一種利用廉價 易得的普通淀粉生產G-1-P的方法，本發明具有原料成本低、轉化率高、G-1-P產量高等優 點。
[0006] 一種W淀粉為原料制備葡萄糖-1-憐酸的方法，包括如下步驟：
[0007] (1)將編碼葡聚糖憐酸化酶的基因經稀有密碼子優化后連接到質粒上構建重組質 粒，再將重組質粒轉化到宿主菌中構建重組菌；誘導表達所得重組菌；
[0008] (2)將誘導表達后的重組菌離屯、、收集菌體，制備重組葡聚糖憐酸化酶純酶液；
[0009] (3)將所得重組葡聚糖憐酸化酶純酶液加入淀粉與緩沖液的混合溶液中，85-90°C 下反應，得葡萄糖-1-憐酸；所述淀粉為木馨淀粉、玉米淀粉、馬鈴馨淀粉或小麥淀粉。
[0010] 步驟（1)中所述質粒為祀T-28a(+);所述宿主菌為E.coli BL2UDE3);因此步驟 (1)進一步優選為：
[0011] 將編碼葡聚糖憐酸化酶的基因經稀有密碼子優化后連接到祀T-28a(+)質粒上， 構建重組質粒祀T-28a-GP，再轉化到E. coli BL21 〇)E3)中，構建重組菌，誘導表達所得重 組菌。
[0012] 優選地，所述編碼葡聚糖憐酸化酶的基因來源于最適溫度為75°C及W上極端嗜 熱菌；進一步優選地，所述極端嗜熱菌為硫化葉菌（Sul化lobus tokodaii)或嗜熱古生菌 (Pyrococcus furiosus);最優選為嗜熱古生菌（Pyrococcus furiosus)。
[0013] 本發明Pyrococ州s化；riosus中編碼葡聚糖憐酸化酶的基因在E. coli中重組表 達，得到的重組酶最適溫度為85-90°C，高于此前報道的其他葡聚糖憐酸化酶。本發明分別 考察了 5%的玉米淀粉和馬鈴馨淀粉在85°C保溫下化后的糊化效果，結果表明，在85°C下 淀粉可W完全糊化，兩者處理后的粘度分別為150CP及390CP，有利于底物與酶的充分接 觸，提高反應速率。
[0014] 由于Pyrococ州S化；riosus是古生菌，培養困難、生長速率和產酶量均很低，故 擬將其基因在常見的表達體系E.coli中重組表達。但由于作為古生菌的Pyrococ州S 化riosus與E. coli的密碼子偏愛性差異顯著，若直接將其基因在E. coli中表達，會導致蛋 白表達量較低。為此，本發明中對Pyrococcus化riosus中編碼葡聚糖憐酸化酶的基因進 行稀有密碼子優化，在E. coli中重組表達，W提高酶的表達量及活力。
[0015] 編碼葡聚糖憐酸化酶的基因經稀有密碼子優化后的堿基序列如SEQ ID NO. 2所 示。優化前的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0016] 步驟（1)中的誘導表達在常規誘導表達培養基上進行，優選地，步驟（1)中誘導表 達重組菌時的誘導條件為：在37°C下培養2-4.化，然后加入誘導劑，25-37°C繼續培養6-10 小時。
[0017] 進一步優選地，所述誘導劑為異丙基硫代半乳糖巧（IPTG);誘導劑的濃度為 0. 05-0. 4mM〇
[0018] 最優選的誘導條件為：于37°C下培養4h后加入0.2mM IPTG，繼續于28°C下誘導 培養化。此時重組葡聚糖憐酸化酶表達量最高。
[0019] 步驟（2)中制備重組葡聚糖憐酸化酶純酶液的方法為：將收集到的菌體破胞得粗 酶液，將所得粗酶液在85-90°C保溫20-40min使宿主菌中蛋白失活沉淀，然后離屯、、其沉 淀，所得上清液即為重組葡聚糖憐酸化酶純酶液。
[0020] 進一步地，將收集到的菌體破胞得粗酶液，將所得粗酶液在85°C保溫30min使宿 主菌中蛋白失活沉淀，然后離屯、、其沉淀，所得上清液即為重組葡聚糖憐酸化酶純酶液，利 用此純化方法所得純酶酶活達27140U，酶活回收率達85. 31 %。
[0021] 步驟（3)中在加入重組葡聚糖憐酸化酶純酶液前對淀粉與緩沖液的混合溶液進 行預處理，即：將淀粉與緩沖液的混合溶液在95-105°C下保溫1. 5-2. 5h。進一步優選地，將 淀粉與緩沖液的混合溶液在l〇〇°C下保溫化后加入重組葡聚糖憐酸化酶純酶液開始反應， 可明顯提高整個反