一種豬藍耳病重組疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程和生物醫藥技術領域，具體涉及一種豬藍耳病重組疫苗。
【背景技術】
[0002]豬藍耳病又稱“豬繁殖與呼吸綜合癥”，是由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)感染引起的以懷孕母豬繁殖障礙及各年齡段豬呼吸道疾病為主要特征的豬傳染病。豬藍耳病是一種在豬群中大范圍流行的疾病，在許多國家都有發現且影響著全世界養豬業和食品的安全。因其是危害養豬業最嚴重傳染病之一，現已被國際獸醫局列為B類傳染病，我國將其列為二類傳染病。目前豬藍耳病已遍布全球主要養豬國家和地區，給全球養豬業造成了巨大經濟損失，對我國養豬業危害也極其嚴重。
[0003]傳統疫苗的應用為我國動物疫病的防控做出了巨大貢獻，目前依然是我國控制動物傳染病的主要手段。目前針對高致病性豬藍耳病的疫苗有滅活苗和活疫苗兩種，2008年及以前，國內主要是采用滅活苗進行防疫，從2009年4月底，農業部開始批準了第一批共計4家企業生產高致病性藍耳病活疫苗(JXAl-R株)，活疫苗開始進入試點使用。兩種疫苗各有優勢，在免疫實踐中，往往是針對不同的豬以及疫情情況使用不同的疫苗。根據農業部《2010年國家動物疫病強制免疫計劃》，對商品豬和種母豬可選用滅活苗或活疫苗進行免疫，而種公豬選用滅活苗進行免疫。
[0004]但是，由于我國已經投入商品化的活疫苗毒株有很多種，造成我國豬場多種毒株同時存在的復雜情況，現有的疫苗鑒別診斷方法均無法從血清學上對疫苗免疫和野毒感染的豬進行區分，從而給疫病的防控和清除造成巨大的困難。而且目前我們仍未研究清楚能刺激產生保護性免疫的PRRSV抗原，不能有針對性的選取病毒免疫原來制備疫苗；而PRRSV是RNA病毒，病毒基因突變頻率高，病毒蛋白抗原性多變，容易產生變異株逃逸免疫識別等諸多原因，傳統的豬藍耳病疫苗并不能達到很好的免疫效果。因此，研發一種能在血清學上區分疫苗免疫和野毒感染的新型安全高效的疫苗是必然趨勢。
[0005]基因工程疫苗以其安全性好、質量均一、生產成本低、適合開發多價苗和聯苗等諸多優點，成為新型疫苗的研究焦點和開發方向。豬藍耳病病毒0RF5基因上包含T細胞、B細胞抗原決定簇，且其編碼的GP5蛋白具有誘導產生中和抗體的能力，同時0RF5能引起細胞免疫應答。越來越多的證據表明0RF5基因是開發豬藍耳病新型疫苗的首選靶基因。然而，目前許多實驗結果表明利用0RF3基因編碼的GP3蛋白開發的新型疫苗雖然檢測不到抗豬藍耳病病毒的中和抗體，但是對妊娠母豬的繁殖障礙可以提供部分保護。并且許多研究表明0RF5基因和0RF3基因串聯的新型疫苗可以提供更好的免疫效果。但是，針對豬藍耳病的有效基因工程疫苗還未上市，更不要說可飼的基因工程疫苗。因此，利用生物反應器開發可飼疫苗非常具有開發價值。
[0006]生物反應器是利用轉基因技術或代謝調控技術在生物個體生產高附加值蛋白質和代謝產物，或者改造植物某種功能成分使之更適于人類利用的一種生物制藥和蛋白生產技術。其中，被稱為“天然生物反應器”的植物表達體系正在引起工業和醫學界越來越多的關注，目前已成為生產高附加值的口服疫苗、醫用蛋白、單克隆抗體的重要途徑，是國外生物產業的研發熱點之一。但目前動植物生物反應器仍然存在轉基因困難、生長周期長、分離純化困難、成本高及因擔心基因漂移而造成的環境釋放困難等問題。食藥用真菌生物反應器作為動植物生物反應器的完美補充，具有基因轉化容易、生長周期短、無需在室外環境中釋放等優點，是具有重要開發價值的生物反應器受體系統。
【發明內容】
[0007]
本發明的目的是提供一種融合基因PCB130NG-0RF3-0RF5及一種豬藍耳病重組疫苗。
[0008]一種融合基因0RF3-0RF5，它的堿基序列如序列表SEQ ID N0.4所示。
[0009]一種融合蛋白0RF3-0RF5，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.5所示。
[0010]一種表達載體 pCB130NG-6^/^-6i/^5.，它是:
1)用Hindill和EcoRi雙酶切pCAMBIA1300載體，去除MCS區，經DNA聚合酶Klenow酶補平后，用T4連接酶連接形成中間載體PCB130-1 ;
2)在pCB130-l的Sphl位點處引入SEQID N0.1所示的基因，包含左右邊界序列和多克隆位點，構建成中間載體PCB130-2 ;
3)PCB130-2分別在Pstl酶切位點處引入真菌特異性啟動子GPD，在Sad與EcoRV酶切位點之間引入Afes終止子，構建成真菌特異性雙T-DNA表達載體，命名為pCB130NG ;
4)經^和Kpnl酶切，在pCB130NG中插入SEQID N0.4所示的基因。
[0011]—種豬藍耳病重組疫苗，它是在食藥用真菌的原生質中轉染了一種表達載體pCB 130NG- 0RF3-0RF5,培養轉基因菌絲；
所述的轉基因菌絲經液體培養基發酵后，離心收集菌絲，烘干或凍干后，粉碎；
所述的食藥用真菌為蟲草、靈芝、金針菇或平菇。
[0012]本發明提供了一種豬藍耳病重組疫苗，將豬藍耳病病毒0RF3基因和0RF5基因串聯，構建了融合基因0RF3-0RF5，插入真菌特異性雙T-DNA安全表達載體pCB130NG中，獲得一種表達載體pCB130NG-ft?/^-ft^5.，利用PEG法、農桿菌介導法或電擊法轉化食藥用真菌原生質體，經鑒定為陽性的菌絲體，培養獲得Tl代子實體，利用PCR篩選出只含目的基因而不含選擇標記基因的子實體個體，培養至T2代，獲得穩定表達豬藍耳病病毒基因的轉基因食藥用真菌。通過轉基因真菌菌絲的發酵培養，離心收集菌絲，烘干或凍干后，粉碎制備豬藍耳病重組疫苗。利用本發明生產的豬藍耳病疫苗各批次間質量差異小、產量大、成本低，且可以直接通過口服飼喂動物，具有廣泛的社會效益和經濟效益。
【附圖說明】
[0013]圖1真菌特異性雙T-DNA安全表達載體pCB130NG示意圖；
圖2 pUC57-0RF3-0RF5載體酶切結果；
圖3 pCB130NG-0RF3-0RF5轉化后菌液PCR及質粒酶切結果；
圖4轉基因蛹蟲草菌絲的PCR檢測；
圖5轉基因蛹蟲草的PCR檢測；
圖6 GP3、GP5特異性抗體水平檢測結果； 圖7攻毒后小鼠直腸溫度的測定；
圖8攻毒后小鼠各組織器官中病毒的積累。
【具體實施方式】
[0014]實施例1.真菌特異性雙T-DNA安全表達載體的構建
利用PCAMBIA1300載體作為基礎載體，首先通過歷λΛΙΙ和EcoRi雙酶切，去除MCS區，經DNA聚合酶Klenow酶補平后，用Τ4連接酶連接形成中間載體pCB130_l。接下來，通過基因合成技術在中間載體的辦Al位點處引入一段序列(SEQ ID N0.1)，包含左右邊界序列和多克隆位點，構建成中間載體PCB130-2。在此載體基礎上，通過PCR技術及酶切與連接方法，分別在Pstl酶切位點處引入真菌特異性啟動子GPD (SEQ ID N0.2)，在Sad與EcoRV酶切位點之間引入終止子(SEQ ID N0.3)，構建成真菌特異性雙T-DNA表達載體，命名為PCB130NG，該載體示意圖見圖1。
[0015]實施例2.融合豬藍耳病疫苗基因0RF3-0RF5的設計
為了提高GP3與GP5蛋白片段的免疫活性，將0RF3基因與0RF5基因串聯一起進行構建，并且在兩個蛋白片段中間插入LTB佐劑序列增強免疫效力；同時為使三個蛋白片段表達后在空間上隔開，在兩個基因中間插入Linker ;為便于表達后的檢測，在0RF3基因的5’端和0RF5基因的3’末端加上His標簽。得到的融合免疫蛋白GP3-GP5的氨基酸序列為SEQ ID N0.5 序列 ο
[0016]實施例3.融合基因0RF3-0RF5真菌表達載體的構建
豬藍耳病病毒0RF5基因和0RF3基因為Genebank中已公布的基因序列(GenBank:ACF93752.1和ACF93750.1)。根據真菌對密碼子的偏愛性對融合基因進行密碼子優化后，通過人工合成方法合成SEQ ID N0.4，將該序列合成到載體pUC57上，并在序列兩端添加酶切位點ZAaJ和Kpnlo
[0017]將PUC57-0RF3-0RF5載體和本研究組改造后的真菌特異性表達雙T-DNA安全表達載體PCB130NG (圖1)，分別用^和Kpnl酶切(圖2)，回收酶切產物后，經連接、轉化、鑒定(圖3)，獲得融合基因0RF3-0RF5真菌表達載體pCB130NG -0RF3-0RF5。<