流感病毒rna聚合酶純化或結晶的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種流感病毒RNA聚合酶純化或結晶的方 法。
【背景技術】
[0002] 流感病毒，尤其是甲型流感病毒一直是威脅人類社會的一個大問題，它具有廣泛 的宿主范圍包括人、豬、馬和禽類等，可W造成人類及動物上呼吸道感染，即流行性感冒，由 于其可W借空氣迅速的傳播，在上個世紀造成數次世界性的大流行。流感病毒屬于正黏病 毒科，為負鏈單鏈RNA分節段基因組病毒，其基因組分為8段，目前發現至少可編碼16個蛋 白。雖然目前存在不少抗流感病毒藥物和疫苗，但是送些藥物和疫苗主要針對流感病毒表 面蛋白，如HA，NA和M2。由于流感病毒在藥物壓力下可W通過突變或者基因重組改變其表 面抗原，送些表面蛋白經過突變的毒株將具有抗藥性，從而可能引起無法控制的流感流行。 為了解決藥物和疫苗的抗藥性問題，人們在考慮改變思路來研發廣譜性抗流感藥物。
[0003] 隨著對流感病毒復制機制的研究，人們逐漸將眼光集中在病毒的核糖核蛋白RNP 上。流感病毒RNP是流感病毒復制的核必組分。與病毒表面蛋白不同，流感病毒的RNP更 為保守，它由病毒基因組、RNA聚合酶和纏繞在病毒基因組RNA上的多個核蛋白組成，負責 病毒的轉錄和復制。流感病毒聚合酶是流感病毒復制的核必機器，它是由PA、PB1和PB2 H 個亞基組成的大小約為250千道爾頓（KDa)的H元復合物，可W產生H種類型的RNA，分別 是cRNA、vRNA和mRNA，該聚合酶在病毒的生命活動中既參與病毒基因組的轉錄復制過程， 同時有文章報道該復合物也參與病毒的組裝。
[0004] 盡管人們通過生物化學，遺傳學，生物信息學和結構生物學對流感病毒聚合酶進 行了各方面的深入研究，提出了越來越精細的模型，關于聚合酶的工作機制方面仍然有很 多關鍵問題尚無法解決，例如；聚合酶如何調控轉錄和復制過程；在復制過程中，兩個聚合 酶分子如何協調W啟動和終止復制等；此外，聚合酶還參與病毒的組裝和抵御宿主免疫系 統。為了解決送些問題，十分需要一個原子分辨率的聚合酶整體結構，然而由于流感病毒聚 合酶是一個250KD的復合物，為了 W行使其多種功能，可能具有多種構象，送給結構生物學 研究、尤其是晶體結構的獲得造成了極大的障礙，因此即使經過了數十年的努力，仍沒有流 感病毒聚合酶整體復合物的結構得到報道。
[0005]目前，人們在重組蛋白表達純化，晶體優化和結構解析方面積累了大量的經驗，通 常情況下，純化得到足夠量的穩定均一的蛋白質、并由此獲得結晶仍然是大分子晶體結構 分析的主要瓶頸。
【發明內容】
[0006] 本發明公開了一種流感病毒RNA聚合酶結晶的方法。
[0007] 本發明提供的一種流感病毒RNA聚合酶結晶的方法，包括如下步驟；為先將流感 病毒RNA聚合酶的PB1亞基編碼基因、PA亞基編碼基因和PB2亞基截短體的編碼基因在昆 蟲細胞中共表達、純化，得到RNA聚合酶，再將所述RNA聚合酶與RNA結合形成復合體，再將 所述復合體結晶，得到流感病毒RNA聚合酶晶體；
[0008] 所述PB2亞基截短體為PB2亞基氨基酸序列自N末端起前126位氨基酸殘基形成 的蛋白。
[0009] 上述方法中，所述流感病毒為A型流感病毒，所述A型流感病毒的病毒株具體為 冊NUH1N1或冊肥。
[0010] 上述方法中，所述昆蟲細胞為化曲Five細胞。
[0011] 上述方法中，所述將流感病毒RNA聚合酶的PB1亞基編碼基因、PA亞基編碼基因 和PB2亞基截短體的編碼基因在昆蟲細胞中共表達采用Bac-to-BacBac-to-Bac桿狀病毒 表達系統，所述Bac-to-BacBac-to-Bac桿狀病毒表達系統中的供體質粒為pFas1:Bac，大腸 桿菌為DHlOBac，昆蟲細胞為Sf9。
[0012] 上述方法中，所述PB1亞基的氨基酸序列為序列表中序列1所示；
[001引所述PA亞基的氨基酸序列為序列表中序列3所示；
[0014] 所述PB2亞基的氨基酸序列為序列表中序列2所示；
[0015] 所述PB2亞基截短體的氨基酸序列為序列表中序列2自N末端第1-126位。
[0016] 上述方法中，所述PB1亞基的編碼基因的核巧酸序列為序列表中序列4所示；
[0017] 所述PA亞基的編碼基因的核巧酸序列為序列表中序列6所示；
[0018] 所述PB2亞基截短體的編碼基因的核巧酸序列為序列表中序列5自5'末端第 1-378 位。
[0019] 上述方法中，所述純化為將共表達得到的所述RNA聚合酶依次經親和層析、離子 交換層析和凝膠層析，得到純化后的RNA聚合酶；
[0020] 所述結晶采用的緩沖液由終濃度為2 % -30 %的陽G1000-20000、終濃度為 50mM-500mMNa化和濃度為lOOmM、抑值為8. 5的Tris肥L緩沖液組成；
[0021 ] 所述結晶義用的溫度為4 C -20 C。
[0022] 由上述的方法制備的RNA聚合酶晶體也是本發明保護的范圍。
[0023] 上述的RNA聚合酶晶體在抗流感病毒藥物篩選或疫苗設計和制備中的應用也是 本發明保護的范圍。
[0024] 本發明的實驗證明，經過使用不同的PB2截短體嘗試，發現含有PB2氨基端126 位氨基酸片段的流感病毒聚合酶復合體表達量更高，每升昆蟲細胞培養液可W純化出2-10 毫克蛋白，優于其它截短體表達量（通常為Img/L);純度好，降解輕微（其它截短體存在降 解、聚合等現象較多，該截短體在送些方面表現更好）；結晶重復性更好、晶體更好更大、衍 射也更強。因此，優選含有PB2氨基端126位氨基酸片段的流感病毒聚合酶復合體進行表 達純化結晶。
[00巧]本發明的方法解決了長久W來的一個重要問題，即如何有效表達純化一個含有大 部分流感病毒RNA聚合酶復合體成分的復合體，特別是含有完整PB1結構的該蛋白復合物， 并使之結晶，送一方法不僅為流感病毒聚合酶的結構解析奠定基礎，同時，對抗流感病毒藥 物篩選、廣譜性疫苗和藥物的設計研發進程也將具有重要意義和應用價值。
【附圖說明】
[0026] 圖1為含有PB2-126截短體的流感病毒RNA聚合酶離子交換層析純化結果
[0027] 圖2為含有PB2-126截短體的流感病毒RNA聚合酶凝膠過濾層析純化結果
[0028] 其中，圖2A是未加RNA promoter的凝膠過濾層析結果，目的蛋白峰出現在約56 毫升處；圖2B是加入RNA promoter的凝膠過濾層析結果，目的蛋白峰出現在約53毫升處。 藍色曲線代表UV280吸收曲線；紅色曲線代表UV260吸收曲線。豎粉直線是上樣時刻。
[0029] 圖3為含有PB2-126截短體的流感病毒RNA聚合酶SDS-PAGE電泳結果
[0030] M孔道代表分子量標準樣孔道；S孔道是純化的目的蛋白樣品孔道
[0031] 圖4為含有PB2-126截短體的流感病毒RNA聚合酶晶體圖片
[0032] 兩個圖中箭頭所指為含有PB2-126片段的流感病毒RNA聚合酶復合體結晶圖片， 呈長方塊、立方塊或柱形多邊形。
[0033] 圖5為含有PB2-130截短體的流感病毒RNA聚合酶復合體分子篩純化圖譜
[0034] 圖6為含有PB2-130截短體的流感病毒RNA聚合酶復合體的純化結果
[0035] 其中，圖6A為含有PB2-130截短體的流感病毒RNA聚合酶復合體電泳圖，1-2為媒 柱層析后電泳、3為離子交換后電泳、4-5為分子篩層析后電泳
[003引圖6B為離子交換圖譜，藍色曲線（上面的曲線）為樣品在UV280的吸收情況；紅 色曲線（下面的曲線）代表UV260吸收；黑色曲線代表離子交換鹽濃度的增加過程。
[0037] 圖6C為分子篩純化圖譜，其中黑色曲線代表不加RNA時UV280和UV260吸收情況， 藍色曲線代表加入RNA后復合體洗脫UV280和UV260吸收情況。
[0038] 圖7為含有不同PB2截短體的流感病毒RNA聚合酶復合體純化后的電泳圖譜
[0039] 圖8為含有PB2-130截短體的流感病毒RNA聚合酶復合體電鏡結果及結晶圖片
[0040] 其中A和B為二體及四體的電鏡結構觀察結果、C為四體加入vRNA后的結晶照片、 D為結晶電泳檢測圖
[0041] 圖9為含有不同PB2截短體的流感病毒RNA聚合酶復合體的結晶圖片
【具體實施方式】
[0042] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0043] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0044] 實驗所用昆蟲表達載體pFASTBAC和pFas巧ac-Dual及細胞培養基SF900II SFM 均購自Invitrogen公司。所需RNA均由Takara公司合成，媒親和柱購自Qiagen公司 (Ni-NTA Agarose,產品目錄號；30230)，SP陽離子交換柱化口RAP SP HP，產品目錄號： 17-1152-01)和 Superdex20016/60 凝膠層析柱化iLoadl6/600Superdex200pg，產品目錄 號=28-9893-35)購自GE公司。檢測PA、PB1和PB2所用抗體通過表達相應蛋白多膚，免疫 兔獲得多克隆抗體，經過實驗驗證特異性良好。
[0045] 昆蟲細胞表達體系采用的是Invitrogen公司的Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統 (Bac-t〇-Bac? Ba州lovirus Expression System,目錄號；10359-〇16)，其中供體質粒為 P化stBac，進行重組病毒構建的大腸桿菌為DHlOBac (該菌株含有可在細菌和昆蟲之間轉 移和擴增的穿梭質粒Bacmid和能表達轉座酶的化Iper質粒），昆蟲細胞為Sf9。所用昆蟲 細胞培養基為Invitrogen公司的SF900II SFM。
[0046]本發明的實施例均W流感病毒毒株Influenza virus/A/Guangdong/ goose/196化5N1) ( W下簡稱；H5N1)為例，但其余的流感病毒尤其是A型流感病毒毒株中的 流感病毒RNA聚合酶的H個亞基也可W通過本發明的方法進行結晶。
[0047] 冊N1的RNA聚合酶聚合體的；個亞基包括PB1蛋白、PA蛋白和PB2蛋白，且PB1 蛋白的氨基酸序列為序列1，其編碼基因的核巧酸序列為序列4 ;PA蛋白的氨基酸序列為序 列3,其編碼基因的核巧酸序列為序列6 ;PB2蛋白的氨基酸序列為序列2,其編碼基因的核 巧酸序列為序列5。
[0048] 實施例1、含有PB2-126截短體的流感病毒RNA聚合酶的結晶
[0049] 本實施例預結晶的流感病毒RNA聚合酶聚合體的H個亞基包括PB1蛋