一種產中性蛋白酶的凝結芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種產中性蛋白酶的凝結芽抱桿菌Liu-gl活菌制劑的制備方法，適 用于畜禽養殖業功能性微生態制劑的生產。
【背景技術】
[0002] 飼用微生態制劑是采用農業部認可的動物腸道有益微生物經發酵、純化、干燥而 精制的復合生物制劑，是一種減少或替代抗生素使用的綠色生物添加劑。
[0003] 1989年，美國食品與藥物管理局（抑A)和美國飼料控制官員協會公布了可W直 接飼喂且一般認為是安全的微生物菌種名單共42種，其中包括凝結芽抱桿菌度acillus coagulans)。我國農業部《飼料添加劑品種目錄（2013)》發布的飼料添加劑包括凝結芽抱 桿菌，可飼喂肉雞、生長育肥豬和水產養殖動物。凝結芽抱桿菌為兼性厭氧菌，在有氧條件 下有利于繁殖菌體，在無氧條件下產生大量乳酸。該菌既具有乳酸菌產乳酸的特性，又具有 良好的抗逆性。其芽抱對高溫及低抑環境具有很強的耐受性，可順利通過胃腸道逆環境， 并發揮良好的益生效果，因此可用于制備微生態制劑。
[0004] 凝結芽抱桿菌可發酵葡萄糖、薦糖、麥芽糖、甘露醇、棉子糖、海藻糖產酸而不產 氣。該菌具有豐富的能夠水解大分子物質的胞外酶系，可產生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及纖 維素酶等活性物質，有助于增強胃腸道對食物的消化與吸收能力，提高飼料轉化率，因此可 作為飼用微生態制劑而廣泛應用于畜禽飼養中。此外，凝結芽抱桿菌還可產生P-半乳糖 巧酶與乳酸脫氨酶，因此有助于乳糖不耐受癥人群對乳糖的消化。
[0005] 本發明設及的產中性蛋白酶凝結芽抱桿菌Liu-gl可用于發酵生產活菌制劑。 經過本發明優化培養基配方與發酵條件后，活菌制劑中Liu-gl菌株的活菌數量可達到 l〇iiC即/gW上。將凝結芽抱桿菌Liu-gl活菌制劑添加到畜禽飼料中，可提高畜禽對飼料 中蛋白質的消化吸收。此外，試驗研究表明，該菌還能分泌a-淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶等 酶類，在消化道中與動物體內的消化酶類共同發揮作用，提高飼料利用率。
[0006] 在制備凝結芽抱桿菌活菌制劑過程中，由于發酵培養基配方直接影響凝結芽抱桿 菌的活菌數量、發酵時間和生產成本，故優化發酵培養基的配方是本發明的關鍵技術。
[0007]目前，國內申請凝結芽抱桿菌的專利較多，
【發明內容】
大多是凝結芽抱桿菌的菌種 檢測技術和芽抱的制備方法，如發明專利CN1103160455A公開了 "凝結芽抱桿菌的芽抱制 劑的制備方法"，該專利報道采用半封閉式固體發酵工藝，生長后期氧氣大量減少，刺激芽 抱快速形成；如發明專利CQ102304559A公開了 "凝結芽抱桿菌的巧光定量PCR快速檢測 方法"，該專利報道了一種快速檢測凝結芽抱桿菌的巧光定量PCR方法。
[0008] 關于凝結芽抱桿菌發酵方面的專利：如發明專利CN103289910A公開了 "一種凝 結芽抱桿菌的固體發酵生產方法"，該專利報道了凝結芽抱桿菌的固體發酵生產方法，采用 凝結芽抱桿菌作為發酵菌種，在優化的固體培養基中，溫度為37~4(TC的條件下培養，經 過S級種子擴大培養而進行大規模發酵生產；如發明專利CN103911326A公開了 "凝結芽 抱桿菌益生菌制劑的制備"，該專利報道了一種凝結芽抱桿菌利用分段接種技術，混菌發酵 對菌種的生長、增殖具有互相促進作用，發酵后產品的色澤和口感等感官特征得到改善和 多樣化，同時提高了營養物質降解率；如發明專利CN104232525A公開了"一種凝結芽抱桿 菌活菌制劑的制備工藝"，該專利報道了一種凝結芽抱桿菌活菌制劑的制備工藝，凝結芽抱 桿菌經一、二級種子擴大培養后接入發酵培養基中培養，在發酵過程中通過補料流加碳源 增加芽抱桿菌的數量和轉化率，顯著提高了產量，降低了成本。
[0009]目前有關凝結芽抱桿菌快速檢測、芽抱制備及其活菌制劑制備方法已見專利報 道。但是，關于利用產中性蛋白酶的凝結芽抱桿菌制備活菌制劑的方法尚未見國內外相關 文獻報道和專利報道。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的在于提供一種產中性蛋白酶的凝結芽抱桿菌Liu-gl活菌制劑的制 備方法。
[0011] 本發明是通過W下技術方案實現的：
[0012] 本發明所設及的凝結芽抱桿菌度acillus coagulans)Liu-gl，分離篩選自傳統干 酪中，已于2015年5月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（簡稱 CGMCC)，保藏號為：CGMCCNo.10790。在腦屯、浸液度HI)培養基上，凝結芽抱桿菌度acillus coagulans) Liu-gl的菌落大小為2~4mm，灰白色、不透明、表面濕潤、邊緣不整齊，菌落表 面初期（45°C，培養6~8h)扁平，后期皺權凸起；菌體細胞呈大桿狀，長短不一，中生芽抱， G+好氧嗜熱菌。
[0013] 所述方法中，采用單因素多水平和正交試驗對凝結芽抱桿菌Liu-gl發酵培養基 配方進行優化，優化后的發酵培養基配方為（質量體積比濃度，W/V) :1%玉米淀粉，1%大 豆巧，0. 2 %碳酸巧，蒸饋水1000血，pH7. 5。
[0014] 所述方法中，在上述試驗結果基礎上，采用單因素多水平和正交試驗進行凝結芽 抱桿菌Liu-gl發酵條件的優化。優化后的發酵條件為：發酵液初始抑7. 5,發酵時裝液量 50血/250血S角瓶，接種量2%，發酵溫度45°C，搖床轉速18化/min,發酵時間48h。
[0015]所述方法中，將上述1L優化發酵培養基裝入化自動發酵罐中進行高密度分批發 酵，接種量為2 %，控制發酵溫度45°C，發酵液初始抑7. 5,攬拌轉速180~22化/min,發酵 時間48h，得到凝結芽抱桿菌Liu-gl發酵液。
[0016] 上述方法中，5L自動發酵罐由上海高機生物工程有限公司生產，其型號為 BI0F6005GBN。
[0017] 所述方法中，在上述試驗結果基礎上，利用立式高速冷凍離屯、機將1L發酵液于 4°C條件下，500化/min離屯、20min，棄上清液，收集得到菌泥。
[0018] 所述方法中，立式高速冷凍離屯、機由湘儀離屯、機儀器有限公司提供，型號為 化-21M。
[0019] 所述方法中，將收集的菌泥加入到發酵液原體積1/10的含有10. 5%麥芽糊精、 4%馬鈴馨淀粉和5. 5%乳清粉（質量體積比濃度，W/V)凍干保護劑中，混合均勻后，得到凝 結芽抱桿菌Liu-gl與凍干保護劑的混合物。
[0020] 所述方法中，將上述混合物于-36°c低溫冰箱中預凍1化至完全凍結狀態，得到預 凍活菌制劑。
[0021] 所述方法中，利用化LABC0NC0真空冷凍干燥機（美國）將預凍活菌制劑于凍干 溫度-55°C、真空度0.ISmBar的條件下，凍干4化至完全干燥狀態，得到產中性蛋白酶的凝 結芽抱桿菌Liu-gl凍干活菌制劑。
[0022] 所述方法中，采用小試發酵生產技術和凍干工藝所得到的產蛋白酶凝結芽抱桿菌 Liu-gl活菌制劑的活菌數量可達到l〇iiC即/gW上，菌種存活率可達85%W上。
[0023] 上述方法得到的產中性蛋白酶凝結芽抱桿菌Liu-gl活菌制劑的制備方法，W及 專用生產菌株屬于本發明保護范圍。
【具體實施方式】
[0024] 下述實施例對本發明作進一步說明而不限制本發明的保護范圍。
[00巧]下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
[0026] 下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為體積分數。
[0027] 實施例1、產中性蛋白酶的凝結芽抱桿菌Liu-gl活菌制劑的制備 [002引1、菌種活化
[0029] 將凝結芽抱桿菌Liu-gl斜面或平板培養物接種于裝有滅菌的5mLBHI培養基試 管中，于45°C轉速為15化/min的搖床培養1化活化培養一代。而后W2%的接種量移種于 裝有滅菌的5mL基礎培養基試管中，于37°C轉速為15化/min的搖床培養4化活化培養二 代，得到活化菌種。
[0030] 凝結芽抱桿菌Liu-gl基礎培養基配方為（質量體積比濃度，W/V) :1%葡萄糖，1% 蛋白腺，0. 2%化C1，蒸饋水1000血，pH7. 0。
[0031] 2、發酵培養基配方的優化
[0032] (1)單因素多水平試驗確定發酵培養基配方
[0033] 碳源的確定：將基礎培養基中的碳源分別由葡萄糖、薦糖、可溶性淀粉、纖維素、麥 芽糖代替，將凝結芽抱桿菌Liu-gl活化菌種W2%的接種量移種于盛有50mL滅菌培養基 的250mLS角瓶中，于37°C轉速為15化/min的搖床培養48h，采用平板計數培養基W傾注 法檢測發酵液中的活菌數量，結果見表1。
[0034] 表1發酵培養基碳源對發酵液中Liu-gl菌株活菌數的影響
[0035]
[0036] 由表1可知，五種不同的碳源條件下，凝結芽抱桿菌Liu-gl的活菌數有差異，其中 葡萄糖作為碳源的活菌數最低，僅為3. 3X108CFU/mL;玉米淀粉作為碳源時活菌數最高，為 4. 53Xl〇9CFU/mL。故選取玉米淀粉為發酵培養基的碳源。
[0037] 氮源的確定：在確定碳源為玉米淀粉的基礎上，將基礎培養基中的氮源分別由花 生教皮、大豆巧、玉米教皮、棉巧巧、小麥教皮代替，w上述同樣條件和方法進行發酵與活菌 計數，結果見表2。
[0038] 表2發酵培養基氮源對發酵液中Liu-gl菌株活菌數的影響
[0039]
[0040] 由表2可知，五種不同的有機氮源條件下，凝結芽抱桿菌Liu-gl的活菌數有差異， 其中玉米教皮作為氮源條件下的活菌數最低，僅為3. 0X107CFU/mL;大豆巧作為氮源時活 菌數最高，為2. 53X109CFU/mL。故選取大豆巧為發酵培養基氮源。
[0041] 無機鹽的確定：在確定玉米淀粉和大豆巧分別為碳源和氮源的基礎上，將基礎培 養基中的無機鹽分別由氯化鋼、氯化巧、硫酸儀、硫酸儘、碳酸巧代替，W上述同樣條件和方 法進行發酵與活菌計數，結果見表3。
[0042] 表3發酵培養基無機鹽對發酵液中Liu-gl菌株活菌數的影響
[0043]
[0044] 由表3可知，在含有五種不同的無機鹽發酵培養基中，凝結芽抱桿菌Liu-gl的活 菌數有明顯差異，其中硫酸儘作為無機鹽條件下的活菌數最低，僅為1. 〇Xl〇7CFU/mL;而碳 酸巧、氯化巧和氯化鋼作為無機鹽時活菌數均大于l〇9CFU/mU其中碳酸巧作為無機鹽時活 菌數最高，為9. 33X10化即/血。此外，碳酸巧還具有調節發酵液抑的作用，故選取碳酸巧 為發酵培養基中的無機鹽。
[0045] (2)正交試驗優化發酵培養基配方
[0046] 根據單因素多水平試驗結果，選擇1%、2%、4%的玉米淀粉（碳源），1%、2%、4% 的大豆巧（氮源），〇.2%、0.4%、0.6%的碳酸巧（無機鹽）設計^因素^水平比9(3 3)]正 交試驗，W上述同樣條件和方法進行發酵與活菌計數，結果見表4。
[0047] 表4優化凝結芽抱桿菌Liu-gl發酵培養基配方[U (33)]正交試驗結果表
[0048]
[0049] 由表4極差分析可知，影響發酵液Liu-gl菌株活菌數的因素主次順序為：C>B > A,即無機鹽含量對活菌數的影響最大，氮源大豆巧含量對活菌數的影響相對略小，而碳 源玉米淀粉含量對活菌數的影響最小；由K值分析Kai>KA2>KA3,Kbi>Kb3>KB2,Kci>KC2 > Kc3可知，發酵培養基配方最優組合為AiBA，即碳源含量為1%，氮源含量為1%，無機鹽 含量為