Pcsk9拮抗劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及單克隆技術領域，具體涉及一種PCSK9拮抗劑。
【背景技術】
[0002] 蛋白原轉化酶枯草溶菌素-可新9型（proproteinconvertase subtilisin-kexintype9)(下文稱為"PCSK9"），又名神經凋亡調節轉化酶1( "NARC-1"）， 是一種蛋白酶K樣枯草桿菌酶，經鑒定為分泌型枯草桿菌酶家族的第9個成員；（Seidah 等，2003PNAS100 :928-933)。編碼PCSK9 的基因定位在人染色體Ip33-p34. 3;Seidah 等，見上文。PCSK9在能夠增殖和分化的細胞中表達，包括例如肝細胞、腎間質細胞、回 腸（intestinalileum)和結腸上皮以及胚胎端腦神經元（Seidah等，2003PNAS100: 928-933)。
[0003]PCSK9在肝細胞和神經元細胞的分化中發揮作用（Seidah等，2003PNAS100: 928-933)，在胚胎肝臟中高表達，并且與膽固醇體內平衡強烈相關。最近的研究似乎暗示 了其在膽固醇生物合成或攝取中的特定作用。在飼喂膽固醇的大鼠的研究中，Maxwell等 發現，PCSK9以類似于牽涉膽固醇生物合成的三個其他基因的方式被下調（Maxwell等， 2003J.LipidRes. 44 :2109-2119)。有趣的是，和牽涉膽固醇代謝的其它基因一樣，PCSK9的 表達也受留醇調控元件-結合蛋白（"SREBP"）的調控（Maxwell等，2003J.LipidRes. 44: 2109-2119)。后來研究證明此類調控在參與脂蛋白代謝的其它基因中非常典型（Dubuc等， 2004Arterioscler.Thromb.Vase.Biol. 24 :1454-1459)。PCSK9 的表達被他汀類（statins) 上調，這是由于這些藥物的降膽固醇效應。此外，PCSK9啟動子有兩個涉及膽固醇調控的保 守性位點、留醇調控元件和Spl位點；見上文。PCSK9的腺病毒表達已顯示可導致循環LDL 顯著的時間依賴性增加（Benjannet等，2004J.Biol.Chem. 279 :48865-48875)。此外，刪 除PCSK9基因的小鼠肝LDL受體水平增加，LDL從血漿中清除更快；Rashid等，2005Proc. Natl.Acad.Sci.USA102 :5374-5379。最近據報道，將用PCSK9瞬時轉染的H印G2細胞的培 養基轉移到未轉染的H印G2細胞時，減少細胞表面LDLR的數量和LDL的內化；參見Cameron 等，2006HumanMol.Genet. 15 :1551-1558。結論是PCSK9或者經PCSK9作用的因子被分泌并 能夠降解轉染的和未轉染的細胞中的LDLR。更近來，據證實，加到H印G2細胞培養基中的純 化PCSK9具有以劑量和時間依賴性方式減少細胞表面LDLR數目的作用（Lagace等，2006J. Clin.Invest. 116 :2995-3005)。
[0004]PCSK9基因中的很多突變已確定與以下病癥相關：常染色體顯性高膽固醇血癥 ("ADH"）、以血漿中低密度脂蛋白（"LDL"）顆粒顯著升高為特征的遺傳性代謝紊亂（可 導致早發性心血管衰竭）；（Abifadel等，2003NatureGenetics34 :154-156；Timms等， 2004Hum.Genet. 114 :349-353 ;Leren，2004Clin.Genet. 65 :419-422)。后來Abifadel等發 表的對S127R突變的研究報道，攜帶這種突變的患者血漿中總膽固醇和apoBlOO較高，原因 是⑴含有apoBlOO的脂蛋白例如低密度脂蛋白（"LDL")、極低密度脂蛋白（"VLDL"）和 中密度脂蛋白（"IDL"）的過量產生，和（2)所述脂蛋白清除或轉化的相關減少。
[0005] 綜合起來，上述研究證實了PCSK9在調控LDL產生中起作用的事實。PCSK9的表達 或上調與增加的LDL膽固醇的血漿水平有關，PCSK9表達的抑制或缺乏與LDL膽固醇血漿 水平低有關。值得注目的是，與PCSK9序列變化相關的較低水平的LDL膽固醇可提供針對 冠心病的保護（Cohen，2006N.Engl.J.Med. 354 :1264-1272)。臨床試驗已證明LDL膽固醇含 量減少與冠狀動脈（coronary)事件率直接相關（Law等，2003BMJ326:1423-1427)。此外， 最近已證明，血漿LDL膽固醇含量終生中度減少與冠狀動脈事件的發生率大幅減少顯著相 關；甚至在非脂質相關心血管風險因子高度盛行（prevalence)的群體中也是如此。因此， 對LDL膽固醇含量進行管理控制大有裨益。
[0006] 因此，制備抑制或拮抗PCSK9活性和PCSK9在各種治療狀況下所發揮的相應作用 的、基于治療的PCSK9拮抗劑非常重要。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題是提供PCSK9拮抗劑、藥物組合物及其用途。
[0008] 本發明涉及PCSK9拮抗劑，特別是人PCSK9拮抗劑。PCSK9的蛋白特異性拮抗劑 (或本文稱為"PCSK9特異性拮抗劑"）是有效抑制PCSK9功能的PCSK9蛋白特異性結合分 子或蛋白，它們在治療與PCSK9功能相關或受PCSK9功能影響的病癥中非常重要，所述病癥 包括但不限于高膽固醇血癥、冠心病、代謝綜合征、急性冠狀動脈綜合征和相關病癥。PCSK9 特異性拮抗劑的特征在于，對PCSK9的選擇性識別和結合。PCSK9特異性拮抗劑不顯示對 除PCSK9之外的物質的顯著結合，除了在那些特殊情況下：使拮抗劑補充帶有另外的、與 PCSK9特異性結合部分不同的特異性。在【具體實施方式】中，PCSK9特異性拮抗劑與人PCSK9 結合的KD為1. 2X10-6或更少。在【具體實施方式】中，PCSK9特異性拮抗劑與人PCSK9結合的 KD為1X10-7或更少。在另外的實施方式中，PCSK9特異性拮抗劑與人PCSK9結合的KD為 1X10-8或更少。在其它實施方式中，PCSK9特異性拮抗劑與人PCSK9結合的KD為5X10-9 或更少，或1X10-9或更少。其他實施方式中，PCSK9特異性拮抗劑與人PCSK9結合的KD為 1X10-10或更少，1X10-11或更少，或1X10-12或更少。在【具體實施方式】中，PCSK9特異性拮 抗劑不以上述水平結合其它蛋白。
[0009] PCSK9特異性拮抗劑有效抵抗對細胞LDL攝取的PCSK9依賴性抑制。已屢次證明， PCSK9特異性拮抗劑對PCSK9對LDL攝取的影響呈劑量依賴性抑制。因此，PCSK9特異性拮 抗劑對降低血漿LDL膽固醇水平非常重要。所述拮抗劑還可在檢測和定量PCSK9中用于各 種診斷目的。
[0010] 在【具體實施方式】中，本發明包括PCSK9特異性拮抗劑，以及，在【具體實施方式】中， 本發明包括抗體分子，所述抗體分子包含公開的重鏈和/或輕鏈可變區、具有一個或多 個保守性氨基酸取代的等同物和它們的同源物（homologs)。【具體實施方式】包括分離的 PCSK9特異性拮抗劑，所述拮抗劑含有公開的CDR結構域或重鏈和/或輕鏈CDR結構域 的組（sets)以及它們的以具有一個或多個保守性氨基酸取代為特征的等同物。本領域 技術人員將理解，可將保留了拮抗PCSK9能力的PCSK9特異性拮抗劑片段插入各種構架 (frameworks)中，參見例如美國專利6, 818, 418以及其中的參考文獻，它們討論了可用于 展示抗體環的各種支架（scaffolds),所述抗體環之前基于抗原結合來選擇。另選方案中， 可使用重組方法摻入編碼VL和VH的基因，例如使用可使VL和VH成為單一蛋白鏈（或者 稱為單鏈Fvs( "ScFVs"））的合成接頭，在該單一蛋白鏈中VL和VH區域配對形成單價分 子；參見例如，Bird等，1988,Science242 :423_426,以及Huston等，1988Proc.Natl.Acad. Sci.USA85 :5879-5883。
[0011]PCSK9特異性拮抗劑和片段可以是各種非基于抗體的支架的形式，包括 但不限于高親和性多聚體（avimers)(Avidia) ;DARPins(MolecularPartners);Adnectins(Adnexus)，Anticalins(Pieris)和Affibodies(Affibody)。科學文獻中對用于 蛋白結合的可選支架的使用進行了很多評價，參見例如Binz&Pliickthun，2005Curr.Opin. Biotech. 16 因此，具有PCSK9選擇性的、可抵抗對細胞LDL攝取的PCSK9依賴性抑 制、非基于抗體的支架或拮抗劑分子構成了本發明的重要實施方式。
[0012] 另一方面，本發明提供編碼公開的PCSK9特異性拮抗劑的核酸。在具體方面，本發 明提供編碼PCSK9特異性拮抗劑的核酸，在【具體實施方式】中提供了編碼本文公開的抗體分 子的核酸，所述抗體分子包含本文公開的重鏈可變區和輕鏈可變區以及它們的選擇組分， 尤其是公開的各自的CDR3區域。另一方面，本發明提供包含所述核酸的載體。另一方面， 本發明提供包含編碼公開的PCSK9特異性拮抗劑（在特定實施方式中是所述公開的抗體分 子和它們的組分）的核酸的分離的細胞。另一方面，本發明提供包含本發明多肽或載體的 分離的細胞。
[0013] 另一方面，本發明提供制備選擇性結合PCSK9的PCSK9特異性拮抗劑的方法，所述 PCSK9特異性拮抗劑包括抗體、抗原結合片段、衍生物、嵌合分子、上述任何物質與另一種多 肽的融合物、或能夠特異性結合PCSK9的可選結構/組成（compositions)。該方法包括在 允許PCSK9特異性拮抗劑表達和/或裝配（assembly)的條件下培養細胞并從細胞中分離 所述拮抗劑，所述細胞包含編碼PCSK9特異性拮抗劑的核酸，或包含編碼它們的一個或多 個組分的獨立的核酸，其中當所述核酸表達時，合起來（collectively)產生所述措抗劑。
[0014] 本領域技術人員還可用標準的重組DNA技術獲得本文公開的PCSK9特異性拮抗 劑。
[0015] 另一方面，本發明提供拮抗PCSK9活性或功能、或PCSK9的已注意到的作用 (notedeffect)的方法，該方法包括使表達PCSK9(或用PCSK9處理）的感興趣的細胞、細胞 群體或組織樣品與本文公開的PCSK9特異性拮抗劑在允許所述拮抗劑結合PCSK9的條件下 接觸。
[0016] 本發明的【具體實施方式】包括這樣的方法：其中所述細胞是人細胞。根據本發明的 拮抗劑有效抑制PCSK9功能。發現本文公開的PCSK9特異性拮抗劑劑量依賴性抑制PCSK9 對LDL攝取的影響。
[0017] 另一方面，本發明提供在對象中拮抗PCSK9活性的方法，所述對象表現與 PCSK9活性相關的病癥或其中對特定對象而言PCSK9起作用（functioning)是禁忌 (contraindicated)的病癥，所述方法包括給予所述對象治療有效量的本發明PCSK9特異 性拮抗劑。在選擇實施方式中，所述病癥可以是高膽固醇血癥、冠心病、代謝綜合征、急性冠 狀動脈綜合征或相關病癥。另一方面，本發明提供藥物組合物或其它組合物，其包含本發明 PCSK9特異性拮抗劑和藥學上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、穩定劑、緩沖劑或設計用來便 于將所需量的拮抗劑給予治療個體的另選物質（alternative)。
[0018] 本發明還涉及在細胞樣品中鑒定PCSK9拮抗劑的方法，其包括向細胞樣品提供純 化的PCSK9和標記的LDL顆粒；向該細胞樣品提供懷疑是PCSK9拮抗劑的分子；培養該細胞 樣品一段時間，所述時間足以允許細胞攝取LDL顆粒；通過除去上清液來分離細胞樣品中 的細胞；減少（reducing)標記的LDL顆粒的非特異性結合；裂解細胞；定量細胞裂解物中 保留的標記物的量；以及鑒定導致定量的標記物的量相比于單獨給予PCSK9時觀察到的標 記物的量有所增加的那些候選拮抗劑。導致定量的標記物的量增加的候選拮抗劑是PCSK9 拮抗劑。已證明該方法是用于鑒定PCSK9特異性拮抗劑的有效手段，因此形成了本發明的 重要方面。
[0019] 下表提供了本發明中所討論的序列的概覽
【附圖說明】
[0022] 圖1說明抗體表達載體pV73;
[0023] 圖2說明外極性（Exopolar)PCSK9突變體的效力如何與血漿LDL-膽固醇相關；
[0024] 圖3抗體分子F16-15劑量依賴性抑制PCSK9對LDL攝取的影響；
[0025] 圖4抗體分子F16-15的IC-50的計算
[0026] 圖51CX1G08顯示對細胞LDL攝取的PCSK9依賴性抑制；
[0027] 圖6F16-15當被注射至小鼠時對血清膽固醇的作用；
[0028] 圖7F16-15當被注射至小鼠時對血清膽固醇的時間進程試驗。
【具體實施方式】
[0029] 本發明涉及PCSK9拮抗劑，特別是人PCSK9拮抗劑。根據本發明的PCSK9的蛋白 特異性拮抗劑（或"PCSK9特異性拮抗劑"）有效抑制PCSK9的功能，從而在治療與PCSK9 功能相關/受PCSK9功能影響的病癥中非常重要，所述病癥包括但不限于高膽固醇血癥、冠 心病、代謝綜合征、急性冠狀動脈綜合征和相關病癥