針對組織因子途徑抑制劑(tfpi)的優化的單克隆抗體的制作方法
【專利說明】針對組織因子途徑抑制劑（TFPI)的優化的單克隆抗體
[0001] 本申請是申請日為2011年03月01日，申請號為201180022078. 8,發明名稱為"針 對組織因子途徑抑制劑（TFPI)的優化的單克隆抗體"的發明專利申請的分案申請。
[0002] ZhuozhiWang,JunliangPan,JoannaGrudzinska，ChristianVotsmeier,Jan TebbejJoergBirkenfeldjNinaWobstjSimoneBrlicknerjSusanneSteinig，PeterScholz
[0003] 序列表提交
[0004] 與本申請有關的序列表經由EFS網以電子形式提交，并且在此通過提及而將其完 整收入說明書中。 發明領域
[0005] 提供了結合人組織因子途徑抑制劑（TFPI)的分離的單克隆抗體及其片段。
[0006] 發明背景
[0007] 血液凝固（bloodcoagulation)是血液形成穩定的凝塊以使流血停止的過程 (process)。該過程牽涉血液中循環的許多酶原和輔因子原（或"凝固因子"）。那些酶原 和輔因子原經由序貫或同時將它們轉化成活化形式的數種途徑而相互作用。最后，所述過 程導致在存在因子Va、離子鈣、和血小板的情況中由激活的因子X(FXa)將凝血酶原激活為 凝血酶。激活的凝血酶繼而誘導血小板聚集，而且將血纖蛋白原轉化成血纖蛋白，其然后被 激活的因子XIII(FXIIIa)交聯以形成凝塊。
[0008] 可以通過兩種獨特的途徑來實施導致因子X激活的過程：接觸激活途徑（以前稱 為內源性途徑）和組織因子途徑（以前稱為外源性途徑）。先前認為，凝固級聯由連接至共 同途徑的同等重要的兩種途徑組成。現在知道用于啟動血液凝固的主要途徑是組織因子途 徑。
[0009] 因子X可以被與激活的因子VII(FVIIa)聯合的組織因子（TF)激活。因子Vila和 其必需的輔因子TF的復合物是凝固（clotting)級聯的一種有力的引發劑（initiator)。
[0010] 凝固的組織因子途徑受組織因子途徑抑制劑（"TFPI"）負控制。TFPI是FVIIa/TF 復合物的一種天然的、FXa依賴性反饋抑制劑。它是多價Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑的 成員。在生理學上，TFPI結合激活的因子X(FXa)以形成異二聚體復合物，其隨后與FVIIa/ TF復合物相互作用以抑制其活性，如此關閉凝固的組織因子途徑。原則上，阻斷TFPI活性 可以恢復FXa和FVIIa/TF活性，如此延長組織因子途徑作用的持續時間，而且放大FXa的 生成，所述FXa是血友病A和B的共同缺陷。
[0011] 實際上，一些初步實驗證據已經指明，通過針對TFPI的抗體來阻斷TFPI活 性使延長的凝固時間正常化或者縮短流血時間。例如，Nordfang等顯示了血友病血漿 的延長的稀釋凝血酶原時間（diluteprothrombintime)在用針對TFPI的抗體處理 血衆后正常化（Thromb.Haemost, 1991，66 (4) : 464-467)。類似地，Erhardtsen等顯不 了通過抗TFPI抗體顯著縮短血友病A兔模型中的流血時間（BloodCoagulationand Fibrinolysis, 1995, 6:388-394)。這些研究提示了抗TFPI抗體對TFPI的抑制對于治療血 友病A或B可以是有用的。在這些研究中僅使用多克隆抗TFPI抗體。
[0012] 使用雜交瘤技術，制備并鑒定針對重組人TFPI(rhTFPI)的單克隆抗體。參見 Yang等，Chin.Med.J.，1998, 111(8) :718-721。測試了單克隆抗體對稀釋凝血酶原時 間（PT)和激活部分促凝血酶原激酶時間（APTT)的影響。實驗顯示了抗TFPI單克隆抗 體縮短因子IX缺乏型血漿的稀釋促凝血酶原激酶凝固時間。提示了組織因子途徑不僅 在生理學凝固而且在血友病出血中發揮重要作用（Yang等，HunanYiKeDaXueXue Bao, 1997, 22(4) :297-300)。
[0013] 因而，需要對TFPI特異性的抗體來治療血液學疾病和癌癥。
[0014] 一般而言，已經使用遺傳工程來創建鼠的、嵌合的、人源化的或完全人的抗體 以生成用于人疾病的治療性抗體。顯示了鼠單克隆抗體作為治療劑具有有限的用途， 這是由于短的血清半衰期、不能觸發人效應器功能、和人抗小鼠抗體的生成（Brekke 和Sandlie,"TherapeuticAntibodiesforHumanDiseasesattheDawnofthe Twenty-firstCentury, "Nature2, 53, 52-62，（2003 年I月）。已經顯不了嵌合抗體引起 人抗嵌合抗體應答。人源化抗體進一步使抗體的小鼠構件最小化。然而，完全人抗體完全 避免與鼠元件有關的免疫原性。如此，需要開發完全人抗體以避免與其它形式的遺傳工程 化單克隆抗體有關的免疫原性。特別地，若使用具有鼠構件或鼠起源的抗體，則諸如用抗 TFPI單克隆抗體的血友病治療會需要的長期（chronic)預防處理具有形成對該治療的免 疫應答的高風險，這是由于需要的頻繁劑量給藥和長的療法持續時間。例如，血友病A的抗 體療法可以每周需要劑量給藥，持續患者一生。這對免疫系統會是連續的考驗。如此，需要 用于血友病和相關的遺傳性和獲得性凝固缺乏或缺陷的抗體療法的完全人抗體。
[0015] 已經經由由Koehler和Milstein在"ContinuousCulturesofFusedCells SecretingAntibodyofPredefinedSpecificity,'Nature256,495-497(1975)中所描述 的雜交瘤技術來生成治療性抗體。也可以在原核生物和真核生物中重組生成完全人抗體。 治療性抗體優選抗體在宿主細胞中的重組生成而不是雜交瘤生成。重組生成具有如下的優 點，即較大的產物一致性、可能地較高的生產水平、和受控制的制備，其使動物衍生的蛋白 質的存在最小化或消除動物衍生的蛋白質的存在。出于這些原因，想要具有重組生成的單 克隆抗TFPI抗體。
[0016] 另外，因為TFPI以高親和力結合活化的因子X(FXa)，所以有效的抗TFPI抗體應當 具有相當的親和力。如此，期望具有可以與TFPI/FXa結合競爭的結合親和力的抗TFPI抗 體。
[0017] 發明概述
[0018] 提供了針對人組織因子途徑抑制劑（TFPI)的單克隆抗體。進一步提供了編碼其 的分離的核酸分子。還提供了包含抗TFPI單克隆抗體的藥物組合物和治療遺傳性和獲得 性凝固缺乏或缺陷諸如血友病A和B的方法。還提供了用于縮短出血時間的方法，其通過 對有此需要的患者施用抗TFPI單克隆抗體進行。還提供了用于生成依照本發明的結合人 TFPI的單克隆抗體的方法。
[0019] 在一些實施方案中，已經優化提供的針對TFPI的單克隆抗體，例如以具有升高的 親和力或升高的功能活性。
[0020] 本發明還涉及如下方面：
[0021] 1. -種結合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含含有 SEQIDN0:1中所顯示的氨基酸序列的重鏈，其中所述氨基酸序列包含一個或多個氨基酸 修飾。
[0022] 2.項1的分離的單克隆抗體，其中所述修飾選自下組：取代、插入或缺失。
[0023] 3.項2的分離的單克隆抗體，其中所述修飾是取代。
[0024] 4.項3的分離的單克隆抗體，其中所述取代在選自下組的位置處：Ql，R30S31，G33 ，M34,S35,S50, 151，R52,S54,S55,S56,K99 和F104。
[0025] 5?項4的分離的單克隆抗體，其中所述取代選自下組：Q1E,R30S,S31P,S31V,G33A ,G33K,G33P,M34I,M34K,S35L,S35D,S50A,I51D,I51E,R52S,S54F,S54D,S55A,S55G,S55R,S 56G,K99V,K99L和F104Y。
[0026] 6.項1的分離的單克隆抗體，其中所述抗體選自下組：IgGl,IgG2,IgG3,IgG4,IgM ,IgAl,IgA2,分泌性IgA,IgD和IgE抗體。
[0027] 7.項I的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含選自下組的兩個或多個取 代：Q1E,R30S,S31P,S31V,G33A,G33K,G33P,M34I,M34K,S35L,S35D,S50A,I51D,I51E,R52S, S54F,S54D,S55A,S55G,S55R,S56G,K99V,K99L和F104Y。
[0028] 8.項7的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含SEQIDNO: 1中顯示的氨 基酸序列，其中所述序列包含選自下組的下列取代：
[0074] 9.-種結合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含含有 SEQIDN0:2中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修 飾。
[0075] 10.項9的分離的單克隆抗體，其中所述修飾選自下組：取代、插入或缺失。
[0076] 11.項10的分離的單克隆抗體，其中所述修飾是取代。
[0077] 12.項11的分離的單克隆抗體，其中所述取代在選自下組的位置處：D1，12,A13， S21,N26,R28,N29,A32,H33,Y48,Y49,N51,N52,P54,G56,E80,S89,D91,D92,G93,V94,P95 和 V96〇
[0078] 13.項12的分離的單克隆抗體，其中所述取代選自下組：D1S,I2Y，A13S,S21T，N26 A,R28P,N29K,A32N,H33Y,Y48F,Y49R,N51S,N51V,N52G,P54L,G56D,E80M,S89A,D91L,D91R, D91W,D91K,D92S,D92T,G93S,V94T,P95V,P95A,V96G,V96M和V96W。
[0079] 14?項9的分離的單克隆抗體，其中所述抗體選自下組：IgGl,IgG2,IgG3,IgG4,Ig M,IgAl,IgA2,分泌性IgA,IgD和IgE抗體。
[0080] 15.項9的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含選自下組的兩個或多個 取代：D1S,I2Y,A13S,S21T,N26A,R28P,N29K,A32N,H33Y,Y48F,Y49R,N51S,N51V,N52G,P54L ,G56D,E80M,S89A,D91L,D91R,D91W,D91K,D92S,D92T,G93S,V94T,P95V,P95A,V96G,V96M和 V96ff〇
[0081] 16.項15的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含SEQIDNO:2中顯示的 氨基酸序列，其中所述序列包含選自下組的下列取代：
[0124] 17. -種結合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含：
[0125] (a)包含SEQIDNO: 1中顯示的氨基酸序列的重鏈，其中所述重鏈氨基酸序列包含 一個或多個氨基酸修飾；和
[0126] (b)包含SEQIDNO: 2中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述輕鏈氨基酸序列包含 一個或多個氨基酸修飾。
[0127] 18.項17的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈修飾是取代。
[0128] 19.項18的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈取代包含選自下組的取代：Q1E，R30 S,S31P,S31V,G33A,G33K,G33P,M34I,M34K,S35L,S35D,S50A,I51D,I51E,R52S,S54F,S54D, S55A,S55G,S55R,S56G,K99V,K99L和F104Y。
[0129] 20.項17的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈包含兩個或多個取代。
[0130] 21.項20的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈包含選自下組的取代：
[0176] 22.項17的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈修飾是取代。
[0177] 23.項22的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈取代包含選自下組的取代：D1S，I2Y ,A13S,S21T,N26A,R28P,N29K,A32N,H33Y,Y48F,Y49R,N51S,N51V,N52G,P54L,G56D,E80M,S 89A,D91L,D91R,D91W,D91K,D92S,D92T,G93S,V94T,P95V,P95A,V96G,V96M和V96W。
[0178] 24.項17的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含兩個或多個取代。
[0179] 25.項24的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含選自下組的取代：
[0222] 26.項17的分離的單克隆抗體，其中所述抗體選自下組：IgGl，IgG2,IgG3,IgG4,I gM,IgAl,IgA2,分泌性IgA,IgD和IgE抗體。
[0223] 27. -種結合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含SEQ IDNO:3中顯示的且包含一個或多個氨基酸修飾的氨基酸序列。
[0224] 28.項27的分離的單克隆抗體，其中所述修飾選自下組：取代、插入或缺失。
[0225] 29.項28的分離的單克隆抗體，其中所述修飾是取代。
[0226] 30.項29的分離的單克隆抗體，其中所述取代在選自下組的位置處：Ql，S30,N32， S37,G44, 153,K55,S57,K58,N61，D62,H103,H107,G109 和Y112。
[0227] 31.項30的分離的單克隆抗體，其中所述取代選自下組：Q1E，S30R，N32D，N32E，S3 3G,S37N,G44S,I53T,K55Y,S57K,S57R,K58M,N61G,N61T,D62I,D62R,D62Q,D62L,D62S,D62V ,D62N,D62K,H103D,H103G,H107M,G109A和Y112D。
[0228] 32.項27的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含選自下組的兩個或多個 取代：Q1E,S30R,N32D,N32E,S33G,S37N,G44S,I53T,K55Y,S57K,S57R,K58M,N61G,N61T,D62 I,D62R,D62Q,D62L,D62S,D62V,D62N,D62K,H103D,H103G,H107M,G109A和Y112D。
[0229] 33.項32的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含SEQIDNO:3中顯示的 氨基酸序列，其中所述序列包含選自下組的下列取代：
[0256] 34?項27的分離的單克隆抗體，其中所述抗體選自下組：IgGl，IgG2,IgG3,IgG4,I gM,IgAl,IgA2,分泌性IgA,IgD和IgE抗體。
[0257] 35. -種結合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含SEQ IDNO:4中顯示的且包含一個或多個氨基酸修飾的氨基酸序列。
[0258] 36.項35的分離的單克隆抗體，其中所述修飾選自下組：取代、插入或缺失。
[0259] 37.項36的分離的單克隆抗體，其中所述修飾是取代。
[0260] 38.項37的分離的單克隆抗體，其中所述取代在選自下組的位置處：M4,V30,F31， S32,D33,N35,T36,Y37,N39,L42,K44,Q50,L51,Y54,K55,G56,S57,A60,S61,D97 和S98。
[0261] 39.項38的分離的單克隆抗體，其中所述取代選自下組：M4I，M4L，V30L，F31I，F31 M,F31Y,F31H,S32L,S32R,S32Y,D33F,D33R,N35I,N35L,N35T,N35V,T36N,Y37F,N39D,L42Q, K44R,Q50R,L51R,Y54F,K55L,G56D,G56A,G56V,S57Y,A60D,S61C,D97M,D97T和S98H。
[0262] 40.項35的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含選自下組的兩個或多 個取代：M4I,M4L,V30L,F31I,F31M,F31Y,F31H,S32L,S32R,S32Y,D33F,D33R,N35I,N35L ,N35T,N35V,T36N,Y37F,N39D,L42Q,K44R,Q50R,L51R,Y54F,K55L,G56D,G56A,G56V,S57Y ,A60D,S61C,D97M,D97T和S98H。
[0263] 41.項40的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含SEQIDNO:4中顯示的 氨基酸序列，其中所述序列包含選自下組的下列取代：
[0326] (kkk)V30L+S32R+N35I+T36N ；
[0327] (111)N35V+G56D ；
[0328] (_n)N35L+G56A ;和
[0329] (nnn)D33F+Y54F〇
[0330] 42?項35的分離的單克隆抗體，其中所述抗體選自下組：IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, I gM, IgAl, IgA2,分泌性 IgA, IgD 和 IgE 抗體。
[0331] 43. -種結合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含：
[0332] (a)包含SEQ ID NO: 3中顯示的氨基酸序列的重鏈，其中所述重鏈氨基酸序列包含 一個或多個氨基酸修飾；和
[0333] (b)包含SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述輕鏈氨基酸序列包含 一個或多個氨基酸修飾。
[0334] 44.項43的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈修飾是取代。
[0335] 45.項44的分離的單克隆