用于檢測小麥葉銹的膠體金試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及小麥葉銹病防治領域，具體涉及一種用于檢測小麥葉銹的膠體金試紙 條。
【背景技術】
[0002] 小麥葉銹病（PucciniareconditaRob.exDesm.f.sp.triticiErikss.EtHenn.) 是由小麥葉銹菌引致的真菌性病害，該病害是中國乃至全世界所有產麥國家的一類重要病 害，嚴重發生時會造成15%以上的產量損失。
[0003] 長期以來，小麥銹病的預測預報主要基于定期、大規模的田間病情調查和室內病 菌小種的活體分離、培養和鑒定。不僅耗時費工，而且其結果的準確性和可信度也在很大程 度上取決于調查測報人員的技術水平和經驗，難以滿足快速、高通量診斷檢測的實際需求。 葉銹病和條銹病的苗期癥狀區別不甚明顯，一些基層植物保護人員常常將二者混淆，不能 準確區分。在小麥葉銹菌的潛育階段，寄主的發病癥狀不易觀察，難以界定初侵染的時期和 規模。因此，有必要利用現代生物技術，研發簡單易行、靈敏準確的小麥葉銹菌快速診斷和 檢測手段。
[0004] 近年來，隨著基因芯片和實時PCR技術的發展，基于特定基因序列開發的特異PCR 引物或探針，已被越來越多地用于病害診斷、病原菌鑒定中。DNA/RNA探針技術和聚合酶鏈 式反應（PCR)具有強專化性、高靈敏度以及程序化試驗操作等特點，現已被廣泛用于多種 植物病原真菌的鑒定檢測。中國農業科學院植物保護研究所采用PCR方法，建立了以(6-微 管蛋白序列為基礎的小麥條銹菌和葉銹菌特異性分子診斷檢測技術（曹麗華等，2007;Cao etal.，2008)。該類技術體系是建立在核酸技術基礎上，依靠病原菌基因組中的特異性DNA 序列進行檢測，包括樣品提取、PCR擴增以及擴增產物的分析，用于病害診斷檢測的準確性 和可靠性均較高。
[0005] 然而，該方法步驟繁瑣，從取樣到獲得結果需要一天時間，費時費力，并且需要在 實驗室內進行。因此，需要開發一種快速、簡便、準確的檢測小麥葉銹菌的方法，可以隨時檢 測待測植株是否感染了小麥葉銹菌，從而對小麥葉銹進行早期預警。
【發明內容】
[0006] 根據上述領域存在的不足和需求，本發明提供一種用于檢測小麥葉銹的膠體金試 紙條及其檢測方法，該方法不需要儀器設備，在野外即可進行檢測，能夠快速準確地判斷待 測植株是否患有小麥葉銹病。
[0007] 本發明請求保護的技術方案如下：
[0008] 抗小麥葉銹菌的單克隆抗體，由保藏號為CGMCCNo. 10884的雜交瘤細胞所分泌。
[0009] 分泌抗小麥葉銹菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其保藏號為CGMCCNo. 10884。
[0010] 用于檢測小麥葉銹的膠體金試紙條，包括樣品墊、金標墊、NC膜、吸水紙和PS底 板；所述樣品墊、金標墊、NC膜和吸水紙按樣品層析方向依次設置于PS底板上；
[0011] 其特征在于：所述金標墊上包被有膠體金標記的權利要求1所述的的單克隆抗 體；
[0012] 所述NC膜上按樣品層析方向依次包括檢測線和質控線，所述檢測線上包被有小 麥葉銹菌抗原蛋白，其氨基酸序列如SeqIDNo. 1所示；所述質控線上包被有羊抗鼠二抗。
[0013] 所述金標墊上的抗體包被濃度為0. 12ug/cm。
[0014] 所述NC膜檢測線上的抗原蛋白包被濃度為2mg/ml。
[0015] 所述NC膜質控線上包被的抗體為羊抗鼠二抗，其包被濃度為0. 5mg/ml。
[0016] 用于檢測小麥葉銹菌的方法，其特征在于，采用權利要求3~6所述的膠體金試紙 條按照下列步驟進行檢測：
[0017] (1)將待測樣品滴加在樣本墊上；
[0018] (2)待質控線顯色后，觀察檢測線是否由無色變成紅色；若檢測線變成紅色，則待 測樣品中不含有小麥葉銹菌；若檢測線不變色，則待測樣品中含有小麥葉銹菌。
[0019] 用于制備抗小麥葉銹菌單克隆抗體的方法，其特征在于，以SeqIDNo. 1所示的小 麥葉銹菌抗原蛋白作為免疫原免疫實驗動物。
[0020] 本發明請求保護的抗小麥葉銹菌的單克隆抗體，其亞型為IgGl型，能夠特異識別 小麥葉銹菌的孢子。該抗體由保藏號為CGMCCNo. 10884的雜交瘤細胞所分泌，其效價高、 親和力強、特異性好，與常見的小麥條銹菌、桿銹菌和黑粉菌無交叉反應，可用于檢測樣品 是否含有小麥葉銹菌。
[0021] 本發明還請求保護分泌抗小麥葉銹菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其保藏號為 CGMCCNo. 10884。
[0022] 本發明提供用于檢測小麥葉銹菌的膠體金試紙條，包括樣品墊、金標墊、NC膜、吸 水紙和PS底板，利用膠體金夾心法檢測樣品中是否存在小麥葉銹菌。其檢測原理為：樣品 滴加在樣品墊上后，便朝著吸水紙的方向泳動，金標墊上膠體金標記的抗小麥葉銹菌的單 克隆抗體（金標抗體）溶解，若樣品中沒有小麥葉銹菌，那么當金標抗體到達NC膜上的檢 測線時，金標抗體被檢測線上包被的小麥葉銹菌抗原蛋白捕獲，沉積下來使檢測線變成紅 色，多余的金標抗體繼續向前泳動，被質控線上的羊抗鼠二抗捕獲，使質控線呈現紅色。若 樣本中含有小麥葉銹菌，則金標抗體與小麥葉銹菌孢子結合后向前泳動，越過檢測線，在質 控線上被羊抗鼠二抗捕獲，使質控線呈現紅色，而檢測線不變色。只有當質控線呈現紅色 時，該檢測結果才有效。
[0023] 本發明還提供用于檢測小麥葉銹菌的方法，該方法操作簡單易行，只需將病菌孢 子用0. 02mol/lPBS緩沖液處理后，滴加在本發明試紙條的樣本墊上，室溫反應約5-10min 后，待質控線顯色后，觀察檢測線是否由無色變成紅色；若檢測線變紅，則表明待測樣品中 不含有小麥葉銹菌或者待測植株感染了小麥葉銹菌；若檢測線不變色，則待測樣品中含有 小麥葉銹菌。采用本發明試紙條進行檢測，不需要儀器設備，在實驗室和野外均可進行，從 取材到獲得檢測結果僅需15分鐘，操作十分輕松，能夠對小麥葉銹病進行早期預警，以便 及時采取防治措施，減少病害造成的經濟損失。
[0024] 生物保藏信息：
[0025] 生物材料名稱：Lr-2-3
[0026] 分類命名：對小麥葉銹菌的單克隆抗體雜交瘤細胞株
[0027] 保藏日期：2015年06月05日
[0028] 保藏號：CGMCCNo. 10884
[0029] 保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0030] 地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所
【具體實施方式】
[0031] 以下通過具體實施例對本發明進行解釋和說明，需要聲明的是，下述實施例僅作 為舉例說明，而不以任何方式限制本發明的范圍。
[0032] 生物材料
[0033] 小麥葉銹菌：中國農業科學院植物保護研究所麥類病害研究組
[0034] 試劑與溶液：
[0035]HAuCL4(進口，sigma)，BSA(進口，巴斯夫或sigma)，PEG (20000)，二氯二甲硅烷 + 氯仿，各種普通化學藥品，表面活性劑，緩沖溶液若干。
[0036] 標準品：葉銹菌孢子（濃度：1000 ppm)
[0037] 菌種來源：
[0038]
[0039] 主要材料儀器：
[0040] 劃膜儀（biodotXYZ3060);膠體金顆粒（北京勤邦生物技術有限公司）；電磁加熱 攪拌套式恒溫器；洄流圓形燒瓶；蛇型冷凝管；攪拌子；分光光度計；高速冷凍離心機；烘 箱；切條機（biodotCM4000);除濕機；封口機；NC膜（whatmanFF120);膠體金墊（聚酯膜 whatman);樣品墊（玻璃纖維whatman，S2樣品墊（處理液成分是：以0? 02mol/lPBS為母 液分別添加〇.5%切的1120,2%蔗糖，2%854);吸水紙、？5(國產進口皆可）。
[0041] 實施例1、小麥葉銹菌單克隆抗體的獲得
[0042] 一、雜交瘤細胞的制備
[0043] 實驗動物為BALB/c小鼠，由中國軍事醫學科學院提供。
[0044] 1、抗原制備
[0045] (1)利用軟件對小麥葉銹菌蛋白的基因及氨基酸序列分析后確定具有抗原位點的 一定數量的氨基酸序列，并對其進行合成，獲得合成多肽產物，篩選特異性強的多肽，其氨 基酸序列為：
[0046] SeqIDNo.I:CSSSKYQDSGREKQRTNSDSNDEIGA。
[0047] (2)利用合成后多肽產物分別偶聯蛋白BSA和蛋白0VA，并作為免疫原和包被原使 用，其中免疫原用于免疫小鼠，包被原用于包被檢測使用。
[0048] 2、制備雜交瘤細胞
[0049] (1)挑選小麥葉銹病血清檢測較好的小鼠，進行加強免疫，同時準備SP2/0骨髓瘤 細胞，放在37°C二氧化碳培養箱中進行培養，加強免疫3天后進行融合。
[0050] (2)取已經免疫小麥葉銹菌的的BALB/c小鼠，通過頸脫位致死小鼠，浸泡于75% 酒精中5分鐘。將小鼠取出晾干，放入超凈工作臺中，剪開外皮，暴露出腹腔的上皮，在脾臟 處將上皮剪開小口，取出脾臟，放入培養皿中，用注射器吸取不完全培養液，打到脾臟里面， 吹出脾細胞，如此反復，直至脾臟吹至透明為止。
[0051] (3)用吸管將SP2/0從瓶壁上吹下，再將SP2/0懸液全部移到上述脾細胞懸液中， 把離心管蓋子擰緊。室溫l〇〇〇r/min離心5min。離心好后倒掉上清，用吸水紙將流動液體 吸干，混勻細胞，加入融合劑，2分鐘后緩慢加入不完全培養液進行終止融合。室溫1000 r/ min離心5min，棄掉上清，加入HAT培養液進行鋪板培養。
[0052] (4)用間接酶聯免疫吸附法檢測融合細胞的陽性率，一共有5個孔對葉銹菌有陽 性反應，然后經有限稀釋對檢測出的5個孔的陽性雜交瘤細胞分別進行克隆，篩選得到1個 對葉銹菌陽性顯色較高的細胞株，將其擴大培養并凍存。
[0053]由此獲得了穩定分泌抗小麥葉銹菌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其細胞株編號 為：1C8,送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏號為：CGMCC No.10884。
[0054] 二、單克隆抗體制備
[0055]1、采用體內誘生法大量制備單克隆抗體。
[0056] (1)制備腹水前注意觀察，雜交瘤細胞（CGMCCNo. 10884)生長飽滿，狀態良好，占 總體積的70%即可進行抗體制備。準備好離心管，用無菌的滴定管小心吹打細胞瓶底部，使 細胞從瓶底脫落，此動作重復10次左右，將吹好的細胞無菌轉移至離心管內1000轉/min