多肽、包含該多肽的檢測器件和檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明主要涉及多肽、包含該多肽的檢測器件及檢測試劑盒，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 瘧疾是一種急性傳染病，是目前世界上對人類危害最為嚴重的蚊媒寄生原蟲病， 病原體是瘧原蟲，癥狀為周期性發冷發熱。由于瘧原蟲的生活周期復雜，抗原具有階段特異 性等特點，瘧疾的防治成為世界性的難題之一。其中，惡性瘧疾每年感染3 - 5億人，奪取 數百萬人的生命。2011年11月，世界衛生組織最新統計有2. 16億瘧疾病例發生，死亡率高 達655, 000人。瘧原蟲主要分布在地球熱帶、亞熱帶各國，S卩非洲、東南亞、南美等地區，約 有20億人口仍生活在疫區，每年死于瘧疾的兒童約100萬。我國在華南、華中的某些地區， 特別是云南和海南省為高發區。因此，瘧疾也嚴重阻礙著發展中國家的經濟發展。
[0003] 由于瘧疾治療藥物的特殊性，精確快速的診斷不僅能及時發現并治療瘧疾患者， 大大降低病死率，也能通過早期排除瘧疾，及時挽救感染了其它傳染性疾病患者的生命。以 此同時，精確快速的早期診斷也是對瘧疾實時流行病監測和控制的必要手段。目前，診斷瘧 疾的經典方法仍為血涂片顯微鏡檢法，該方法對檢驗者的技能和檢驗要求很高，遠遠無法 滿足非洲和南美洲等發展中國家中絕大多數生活在偏遠地區患者的需要。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種對瘧疾的診斷有用的多肽、抗該多肽的抗體、包含該 多肽的檢測器件、包含該多肽或該檢測器件的檢測試劑盒、以及該多肽在檢測瘧原蟲引起 的疾病（例如瘧疾）中的用途、該多肽在制備用于檢測瘧原蟲引起的疾病（例如瘧疾）的 試劑盒或檢測器件中的用途。
[0005] S卩，本發明包含下述技術方案：
[0006] 1?由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列構成的多肽。
[0007] 2. -種檢測器件，其包括：
[0008] 固體載體，以及
[0009] 連接于該固體載體上的項1所述的多肽。
[0010] 3.根據項2所述的檢測器件，其中，所述固體載體是SJ改性硅膠。
[0011] 4. -種檢測試劑盒，其包括項1所述的多肽、或者項2或3所述的檢測器件。
[0012] 5.抗項1所述的多肽的抗體。
[0013] 6.項1所述的多肽在制備用于檢測瘧原蟲引起的疾病的試劑盒或檢測器件中的 用途。
[0014] 7.項6所述的用途，其中，所述疾病是瘧疾。
[0015] 8.項6或7所述的用途，其中，所述瘧原蟲是惡性瘧。
[0016] 9.編碼項1所述的多肽的核酸。
[0017] 10.包含項9所述的核酸的表達載體。
[0018] 11.導入了項10所述的表達載體的宿主細胞。
[0019] 將本發明的多肽應用于瘧原蟲引起的疾病（例如瘧疾）的診斷，能夠取得令人滿 意的效果。
【附圖說明】
[0020] 圖1將多肽通過化學共價固定于SJ改性硅膠表面的示意圖。
[0021] 圖2對SJ改性硅膠（iPDMS薄膜）的制作過程進行說明的示意圖。
[0022] 圖3對多肽微陣列化學固定過程進行說明的圖。
[0023] 圖4說明多肽微陣列點樣模式的示意圖。
[0024] 圖5是顯示對健康正常人或非瘧疾病人血清進行檢測的結果的照片。
[0025] 圖6是顯示對瘧疾病人血清進行檢測的結果的照片。
【具體實施方式】
[0026] 本發明的多肽
[0027] 本發明的多肽是30肽。本發明的30肽由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列構成， 即：KRNFSLYKTAFEYLKQKWDKYKELNFSSIF。如實施例所示，其對瘧疾病人的血清呈陽性反應， 而對健康正常人或非瘧疾病人血清呈陰性反應。因此，該30肽作為瘧原蟲（例如惡性瘧） 引起的疾病（例如瘧疾）的診斷工具是有用的。
[0028] 本發明的多肽在有市售的情況下，可以使用市售品，此外，還可以適宜采用（1)化 學合成方法、或（2)酶反應合成方法等公知方法來獲得，其中化學合成更為簡便。在化學 合成本發明的多肽情況下，通過使用肽合成儀合成或者半合成該多肽來進行。作為化學合 成方法，可以列舉出例如肽固相合成法等。這樣合成的肽可以采用常規手段例如離子交換 色譜、反相高效液體色譜、親和色譜等進行純化。這樣的肽固相合成方法以及其后的肽純化 都是本技術領域公知的。
[0029] 此外，在通過酶反應生產本發明的多肽的情況下，可以采用例如國際公開小冊子 W02004/011653號所述的方法。即，可以這樣來生產：將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被 酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態的氨基酸（例如羧基保護的 氨基酸）在肽合成酶的存在下進行反應，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出： 具有生成肽的能力的微生物的培養物、由該培養物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體 處理物、或該微生物來源的肽合成酶。
[0030] 而且，除了上述的酶方法、化學合成方法以外，有些情況下，本發明的多肽還可能 是天然存在（但未被分離出來）的。在天然存在的情況下，還可以將其分離出來。
[0031] 本發明的核酸、表汰載體宿豐細朐，以及抗本發明的多狀的抗體
[0032] 本發明還涉及編碼該多肽的核酸（本發明的核酸）、包含該核酸的表達載體（本發 明的表達載體）、導入了該表達載體的宿主細胞（本發明的宿主細胞），它們優選可用于生 產本發明的多肽。本發明的核酸、表達載體、宿主細胞可以采用本領域技術人員公知的方法 來制備。本發明還涉及抗本發明的多肽的抗體，其可用于檢測本發明的抗體。本發明的抗 體可以采用本領域技術人員公知的方法來制備。
[0033] 本發明的檢測器件
[0034] 本發明還涉及一種檢測器件（本發明的檢測器件），其包括固體載體、以及連接于 該固體載體上的本發明的多肽。
[0035] 在本發明中，對固體載體沒有特殊限制，只要是作為固體或不溶性材料（例如是 可以通過過濾、沉淀、磁性分離等從反應混合物中分離的材料）的載體即可。
[0036] 構成固體載體的材料包括但不限于：硅膠（聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纖維素、特 氟隆TM、硝基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚 酰胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉬、銀、銅、鐵、不銹 鋼、鐵氧體、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白（白蛋白等）、碳或它 們的組合等。
[0037] 固體載體的形狀包括但不要限于：珠子、磁珠、薄膜、微細管、濾膜、板、微量板、碳 納米管、傳感器芯片等。正如本技術領域公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設 置凹坑、溝槽、濾膜底部等。
[0038] 在本發明中，磁珠可以具有約25nm~約Imm范圍的球體直徑。在優選的實施方式 中，磁珠具有約50nm~約IOym范圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選擇。
[0039] 在本發明中，由Sepharose等高交聯球形瓊脂糖制成的珠子具有約24iim~約 165iim范圍的直徑。優選地，高交聯球形瓊脂糖珠具有約24iim~約44iim范圍的直徑。 高交聯球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選擇。
[0040] 具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從Polysciences，Warrington,PA或 Spherotech，Liberville，IL購買的制品等聚苯乙烯膠乳珠。
[0041] 二氧化硅（Si02)_處理或二氧化硅（Si02)基的固體載體的例子包括可從 Polysciences，Warrington,PA購買的超常磁性二氧化娃珠等，其可以用于捕捉核酸（例如 DNA)。或者，還可以使用可從DynalBiotech購買的M-280等。
[0042] 具有親水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的細菌細胞、核酸以及其它成分。作為 該磁珠的例子，可以列舉出Polysciences，Warrington,PA銷售的珠子（名稱：Biomag(注 冊商標）羧基）、或者BangsLaboratory,Inc. ,Fishers,IN的名稱為MC02N/2928 的珠子。 或者，可以使用DynalBiotech銷售的M-270等。
[0043] 在本發明的一個優選實施方式中，所述固體載體是SJ改性硅膠。蘇州傯聚生物 材料有限公司開發的一種硅橡膠材質的微陣列固體支撐材料（iPDMS薄膜，參見中國專利CN101265329A)。這種材料是以生物學研究常用的PDMS為基礎，在其中加入特定的引發劑 成份（使該材料可通過表面引發聚合反應（SIP)實現表面功能化修飾），再經過聚乙二醇甲 基丙烯酸酯（poly(oligo(ethyleneglycol)methacrylate) ,pOEGMA)表面修飾獲得的。SJ 改性硅膠具有優秀的抗蛋白質非特異性吸附（Nonspecificproteinadsorption,NPA)能 力，可以將復雜蛋白免疫檢測中的非特異性蛋白質吸附控制到接近"絕對〇"水平（接近或 低于儀器的檢測極限），不僅可以免除封閉和多次清洗的麻煩，還可以通過使用更強的信號 擴增手段來提高蛋白質微陣列的靈敏性。而且其硅橡膠的本質賦予了該材料較強的機械 性能和良好的可操作性。蘇州傯聚公司已經成功地將SJ改性硅膠應用于11個腫瘤標志物 組成的多指標聯檢微陣列ELISA試劑盒，實現了高通量和高靈敏的檢測，證明了這種材料 是一種優秀的蛋白質微陣列固體支撐材料。同時，這種材料還具有表面性質可調的特性，可 以通過控制修飾反應時間在一定范圍內調整其表面形貌。
[0044] 本發明的多肽與固體載體的連接可以采用本領域技術人員公知的多肽與固體載 體的連接方法來進行。例如，對于蛋白質/多肽與改性硅膠表面的連接而言，可以通過1-乙 基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺
[0045] [l-ethyl-3-(3_dimethylami-nopropyl)carbodiimide,EDC]和N-羥基玻拍醜 亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS)的反應將改性硅膠表面高分子鏈上的羧基（-C00H)基 團改為活化基團，該活化基團可與蛋白/多肽上所帶的氨基（-NH2)反應從而實現將蛋白/ 多肽固定于固體載體表面（參見圖1)。
[0046] 對于點樣時使用的點樣液中本發明的多肽的濃度沒有特殊限制，本領域技術人員 可以依常規選擇，優選為I P g~1000 P g/mL，更優選10 ii g~500 ii g/mL。此外，對于本發 明的多肽在固體載體上分布的密度沒有特殊限制，本領域技術人員可以依常規選擇，優選 為1~100點/10mm2,更優選5~50點/10mm2。
[0047] 本發明的檢測器件可以用于檢測瘧原蟲引起的疾病（例如瘧疾）、或者制備用于 檢測瘧原蟲引起的疾病（例如瘧疾）的試劑盒。
[0048] 本發明的檢測試劑盒
[0049] 本發明還涉及一種檢測試劑盒（本發明的檢測試劑盒），其包括本發明的多肽或 檢測器件。該檢測試劑盒優選用于檢測瘧原蟲引起的疾病（例如瘧疾）。
[0050] 本發明的檢測器件或本發明的多肽是本發明的檢測試劑盒的要件。本發明的檢測 試