一種抗菌肽pd22及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種抗菌肽ro22及其用途。
【背景技術】
[0002] 為了提高母豬繁殖效率和減少母源性疾病的垂直傳播，我國養豬場仔豬一般選擇 3-4周齡斷奶，而斷奶過程在自然界中一般發生在3-4個月。仔豬早期斷奶給仔豬造成了巨 大的應激，仔豬和母豬分開、營養來源從液態的母乳變為固態的飼料、混群和環境的變化， 且早期斷奶仔豬消化系統和免疫系統發育并不完善，極容易受各種病原菌的攻擊而感染疾 病，其中消化道疾病是最常見、最嚴重的疾病之一，也是導致斷奶仔豬生長抑制甚至死亡的 重要原因。長期以來，使用抗生素是預防和治療斷奶仔豬腹瀉的主要手段，但是抗生素的大 量使用導致病原菌耐藥性不斷增強、抗生素使用效果不斷削弱，且生豬生產中抗生素的長 期大量使用導致的畜產品藥物殘留和有害菌種耐藥性增強已經成為威脅人類安全的重大 隱患。因此，尋找能夠替代抗生素解決斷奶仔豬腸道疾病問題的產品是當前動物營養研究 中的熱點課題。抗菌肽是自然界生物中廣泛存在的小分子活性多肽，具有抗菌譜廣、熱穩定 性強和不易產生細菌耐藥性等特點，是替代抗生素理想的潛在物質。然而，天然來源的抗菌 肽大多具有分子量大、抗菌活性不高、對宿主細胞具有毒副作用或能導致宿主溶血等缺陷， 在一定程度上限制了抗菌肽在斷奶仔豬養殖中的推廣應用。通過分子設計和改造是克服天 然來源抗菌肽缺陷、促進抗菌肽在斷奶仔豬養殖中應用的有效手段。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種新的抗菌肽。
[0004] 為實現上述目的，本發明提供一種抗菌肽TO22,其特征在于：所述抗菌肽TO22的 氨基酸序列如SEQIDN0:1所示。具體為：KKIVKAALQAATQ，分子量為1369. 67Da，等電點為 10. 30〇
[0005] 本發明還保護所述抗菌肽TO22的用途，其特征在于，所述用途為抗菌的用途。
[0006] 進一步，所述抗菌為抗大腸桿菌、沙門氏菌和/或魏氏梭菌。
[0007] 進一步，所述用途為用于飼養家禽的用途。
[0008] 進一步，所述家禽為豬、雞、鴨或鵝。
[0009] 進一步，所述豬為乳仔豬、斷奶仔豬、生長豬或種豬。
[0010] 進一步，所述雞為肉雞或蛋雞。
[0011] 進一步，所述用途指的是提高斷奶仔豬日增重和降低料重比。
[0012] 進一步，所述用途指的是降低斷奶仔豬腹瀉率。
[0013] 進一步，所述用途指的是改善斷奶仔豬腸道功能。
[0014] 本發明具有如下優點：本發明中的抗菌肽TO22具有分子量小、人工合成方便且成 本低、對大腸桿菌、沙門氏菌和魏氏梭菌等細菌殺菌作用強、細胞毒性低等優點，在斷奶仔 豬飼料中應用能夠顯著降低斷奶仔豬腹瀉率和提高斷奶仔豬的生長速度。
[0015] 本發明的實施例通過測定抗菌肽F*D22最小抑菌濃度（minimalinhibitory concentration,MIC)來反映其抗菌效果，最小抑菌濃度為檢測不到細菌生長的最低樣品濃 度。結果表明本發明的抗菌肽TO22對大腸桿菌、魏氏梭菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌均有 非常強的殺傷作用。在細胞毒性實驗上，即使在300ug/mL的濃度下，抗菌肽TO22對豬小腸 上皮細胞IPEC-I也存在很低（小于10%)的細胞毒副作用。與陰性對照相比，抗菌肽TO22 可顯著降低斷奶仔豬腹瀉率。抗菌肽PD22可顯著提高斷奶仔豬日增重和降低料重比。顯 著提高斷奶仔豬空腸和回腸絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度的比值，說明抗菌肽TO22能 夠顯著改善斷奶仔豬腸道功能。
【附圖說明】
[0016] 圖1是抗菌肽TO22細胞毒性分析圖；
[0017] 圖2抗菌肽TO22對大腸桿菌攻毒斷奶仔豬（24日齡）腹瀉的影響圖；
[0018] 圖3抗菌肽TO22對24日齡斷奶仔豬腹瀉率的影響圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。實施例中未注明 具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。 所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0020] 實施例1 :抗菌肽TO22的制備
[0021] 抗菌肽TO22的化學合成方法：根據
【發明內容】
中所述氨基酸序列，用全自動多肽合 成儀（ABI433)合成TO22全序列（湖南師范大學生命科學學院合成），并通過HPLC反相柱 層析脫鹽純化；
[0022] 純化的抗菌肽TO22分子量采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜 (MLDI-TOF)測定，等電點使用等電聚焦電泳測定，氨基酸序列采用自動氨基酸序列測定 儀進行解析。
[0023] 抗菌肽TO22,所述的抗菌肽TO22為人工設計合成的活性多肽，包含13個氨基酸殘 基，分子量為1369. 67Da，等電點為10. 30,其氨基酸序列為KKIVKAALQAATQ(SEQIDN0:1)。
[0024] 實施例2:抗菌肽TO22抑菌實驗
[0025]通過測定抗菌肽]^22 最小抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration,MIC) 來反映其抗菌效果，最小抑菌濃度為檢測不到細菌生長的最低樣品濃度。采用二倍稀釋法， 具體方法如下：
[0026] 受試細菌接種于LB固體培養基上，然后于37°C培養箱中倒置培養。待菌落長出 后，用一次性接種環挑取各受試細菌單菌落至LB液體培養基中，37°C培養箱中震蕩培養至 對數生長期。紫外分光光度計上檢測菌液0D600,根據10D600 =IXIO9CFlVmL將受試菌菌 液用液體LB培養基稀釋至2X105CFU/mL。然后在無菌96孔板各孔中加入100yLLB液體 培養基，然后在Al孔中加入100yL稀釋到一定濃度的抗菌肽TO22樣品（抗菌肽樣品加入 前用0. 22ym微孔濾膜過濾除菌），混勻后取100yL加入A2孔，A2孔混勻后再取100yL加 入A3孔，依次倍比稀釋，最后從A12孔吸出100yL棄去，至此抗菌肽TO22二倍濃度梯度樣 制成。向預先加入抗菌肽ro22的各孔中再依次加入已稀釋好的菌液100 y L混勻，于37°C 緩慢震蕩培養16h，然后測定600nm處吸光值。結果計算：取檢測不到細菌生長的孔和與之 相鄰的有細菌生長的孔中抗菌肽TO22濃度之和的平均值作為抗菌肽TO22最小抑菌濃度。 測試結果見表1所示。從表1中可以看出抗菌肽TO22對大腸桿菌、魏氏梭菌、沙門氏菌和 枯草芽孢桿菌（中國科學院亞熱帶農業生態研究所提供）均有非常強的殺傷作用。
[0027]表1 :抗菌肽TO22對各菌的最小抑菌濃度表
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