-單磷酸類脂a的制備及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種新型低毒的Kdo2-單磷酸類脂A的制備及其應用，屬于生物工程 領域。
【背景技術】
[0002] 脂多糖（LPS)，即細菌內毒素，是構成大多數革蘭氏陰性細菌外膜外層的主要成 分，主要由Kdo2-類脂A(Kdo2-LipidA)，核心多糖（Core)和0-抗原（0-antigen)三部分 組成；其中Kdo2-類脂A是LPS的疏水端，其結構非常保守，連接著親水的核心多糖和0-抗 原并協助二者粘附于細胞表面構成完整細胞壁。革蘭氏陰性菌侵入宿主后會釋放其表層的 LPS，LPS可以被宿主免疫細胞表面的Toll樣受體4(TollLikeRec印tor4,TLR-4)識別， 繼而引發細胞內一系列的生理生化反應，產生TNF-a、IL-6、IL_8等多種炎性細胞因子。其 中，Kdo2-類脂A是與TLR-4受體結合的主要部分，尤其是類脂A部分的精細結構決定了LPS 刺激細胞后釋放的細胞因子種類和數量。
[0003] 野生型大腸桿菌和沙門氏菌的類脂A部分一般包含六條或七條脂肪酸鏈并在Cl 位和C4'位連有兩個磷酸基團，具有較高的細胞毒性。而某些特殊結構的類脂A衍生物，則 顯示出較低的毒性，可作為疫苗佐劑，非特異性地增強機體對抗原的免疫應答反應，提高疫 苗效率。但，由于類脂A分子水溶性非常低，在水相中不能展現有效的生物活性，所以近幾 十年至今，基礎科研或者臨床上還是使用LPS粗樣來對相應的類脂A衍生物生物活性進行 研究，但LPS由于核心糖及0抗原部分結構多樣化，分子量大且不均一，無法通過質譜或核 磁共振的方法進行實時檢測和快速鑒定，也暫無標準化的提取純化方法。此外，目前生產類 脂A所采用的沙門氏菌是致病菌且合成多種不同結構類脂A，操作起來比較困難、產品不純 且在水相體系生物活性不佳，還需吸附在某些鹽表面才能與疫苗結合而更好的作用；實際 生產過程中涉及到酸/堿水解等多種化學處理，步驟繁多、成本高，而且在處理過程中會伴 隨脂肪酸鏈的斷裂，破壞化合物有效結構，影響產品質量和產量。
[0004] 大腸桿菌W3110是非致病菌，其LPS部分不包含0-抗原，只有Kdo2-類脂A與核 心多糖，且其Kdo2-類脂A部分結構單一，只包含兩個2-酮-3-脫氧辛酸、六條脂肪酸鏈 和CUC4'位兩個磷酸基團，從細胞內膜內側開始合成，合成途徑非常保守，因此大腸桿菌 W3110是優于沙門氏菌的工業生產出發菌株。而Kdo2-類脂A相對類脂A具有更好的雙親 性，易于直接提取和純化，又能被ESI質譜直接檢測鑒定，在水相體系也具有較好的溶解度 和生物活性。本發明改造大腸桿菌，合成了一種具有特殊結構、低毒的Kdo2-單磷酸類脂A， 這種Kdo2-單磷酸類脂A不含核心多糖長鏈、僅由兩個2-酮-3-脫氧辛酸、六條脂肪酸鏈 和C4'位單個磷酸基團構成。這種特別的Kdo2-單磷酸類脂A，便于分離提取和檢測，工業化 生產效率高、成本低，且這種特別的Kdo2-單磷酸類脂A化合物保持了類脂A部分的有效的 免疫刺激活性，較野生型W3110的LPS也有明顯的減毒作用，是極具發展潛力的疫苗佐劑。 同時，本發明提供一種提取和純化Kdo2-類脂A的標準化方法，步驟簡單明了，易于操作。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的第一個技術問題是提供一種具有特殊結構、減毒的Kdo2-單磷酸 類脂A，其化學式為C11idH2mN2O36P,相對分子質量為2157. 37,是以P-(1'-6)連接的D-葡萄 糖胺二糖為骨架，6'位連接二a-酮基-3-脫氧-D-甘露辛酸（Kdo2)、4'位被磷酸化、3'位 連接（R)-3_(十四烷氧基）十四烷基、2'位氨基連接（R)-3-(十二烷氧基）十四烷基、3位 和2位氨基分別連接十四烷氧基而構成，具體結構式如式I所示：
[0006]
[0007] 本發明要解決的第二個技術問題是提供一種能直接生產所述減毒Kdo2-單磷酸 類脂A的大腸桿菌基因工程菌E.coliW3110AwaaCFAIacIlacZ: :FnlpxE。Kdo2-類脂 A及其衍生物的各種結構現今無法通過化學方法合成，也沒有自然存在的菌株能夠直接合 成Kdo2-類脂A。本發明中所述大腸桿菌基因工程菌是將E.coliW3110染色體基因組中 waaCF、IacI基因發生缺失突變失活，IacZ基因內部分別敲入表達異源的FnlpxE基因所得。 該大腸桿菌基因工程菌無抗生素標記、生長過程中無需誘導劑，能夠直接合成生產出特殊 結構的低毒Kdo2-單磷酸類脂A，且產物單一、純度高、能夠被直接提取且易于純化；菌株具 有較高疏水性、較高自凝集能力以及較低抗生素抗性和更高使用安全性。
[0008] 其構建方法主要包括以下步驟：首先，敲除野生型大腸桿菌W3110染色體上的 IacI基因，IacI基因編碼Iac操縱子中的調節蛋白，敲除該基因可以解除調節蛋白對 后期插入IacZ位點的外源基因表達的阻遏作用，使外源基因形成組成型表達；其次，在 W3110AIacI菌株的基礎上，在染色體IacZ位點處敲入FnlpxE基因，IpxE來源于弗朗西 斯菌，其編碼的蛋白酶可以水解類脂A分子1位上的磷酸，構建得到中間菌株HffOOl;再次， 在HffOOl的基礎上敲除染色體上的waaC-waaF基因簇，構建出菌株BWOOl，使菌株缺失核心 多糖第一第二個糖基轉運酶，從而不連接外核心多糖直接生產出Kdo2-單磷酸類脂A。
[0009] 在本發明的一種實施方式中，構建的IacI敲除片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 1 所示。
[0010] 在本發明的一種實施方式中，構建的FnlpxE-Fkan插入片段的核苷酸序列如SEQ IDNO. 2 所示。
[0011] 在本發明的一種實施方式中，構建的waaCF敲除片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 3 所示。
[0012] 本發明還提供一種方便快捷的應用所述大腸桿菌基因工程菌生產Kdo2-類脂A的 方法，主要包括以下步驟：
[0013] (1)培養菌體：采用一般搖瓶發酵培養，將種子菌液轉接并培養至穩定期初期。
[0014] (2)提取分離：收集菌體，采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法提取Kdo2-類脂A粗 樣。
[0015] (3)DEAE纖維柱純化：Kdo2-類脂A粗樣混合著膜磷脂，通過上樣于DEAE纖維柱再 經梯度洗脫，去除磷脂雜質，得到高純度的Kdo2-類脂A。
[0016] 所述生產方法中不涉及致病菌，并且無需誘導劑，無需化學處理裂解糖鏈，菌株可 用于直接提取獲得減毒Kdo2-單磷酸類脂A的大規模生產；且此株基因工程菌的Kdo2-單 磷酸類脂A產物單一，具有雙親性，在有機相和水相均有一定溶解度，是很好的疫苗佐劑候 選。
[0017] 傳統類脂A的獲得是先用苯酚提取脂多糖，再進行一系列水解、層析、純化等過 程。本發明的特殊Kdo2-單磷酸類脂A具有良好的雙親性質，可以用氯仿甲醇混合體系直 接提取獲得，方法類似于膜磷脂的提取，不用添加苯酚，也無需經過酸/堿水解，較類脂A的 提取過程更為簡單。所提取的Kdo2-單磷酸類脂A樣品可直接通過薄層層析（TLC)和電噴 霧質譜（ESI/MS)檢測、分析，而通常脂多糖由于其含大量親水性糖鏈，分子量過大，脂溶性 極低無法直接通過TLC和EIS/MS分析。
[0018] 在對細胞毒性、免疫刺激活性的評估中，單磷酸類脂A水溶性極低，免疫效果不 佳，在實際臨床時一般還需與其他佐劑結合或吸附于鋁鹽表面才能更好地發揮作用。本發 明的特殊結構Kdo2-單磷酸類脂A樣品在水相細胞培養體系中也呈現較高的溶解度，保持 了類脂A部分的生物活性，較野生型W3110的LPS也有明顯的減毒作用，再加上特殊結構賦 予的雙親性也更有利于其與疫苗成分以多種形式結合，是極具發展潛力的疫苗佐劑候選。
【附圖說明】
[0019] 圖1基因工程菌BWOOl所生產Kdo2-單磷酸類脂A的TLC分析
[0020] I:WBB06Kdo2-類脂A樣品；2:BWOOIKdo2-單磷酸類脂A樣品
[0021] 圖2基因工程菌BWOOl所生產Kdo2-單磷酸類脂AESI/MS分析
[0022] A:WBB06Kdo2-類脂A樣品；B:BWOOIKdo2-單磷酸類脂A樣品
[0023] 圖3野生型大腸桿菌W3IlOLPS與基因工程菌BWOOIKdo2-單磷酸類脂A刺激小鼠 巨噬細胞RAW264. 7毒性分析
[0024] 圖4野生型大腸桿菌W3IlOLPS與基因工程菌BWOOIKdo2-單磷酸類脂A刺激人巨 噬細胞THP-I毒性分析
[0025] 圖5野生型大腸桿菌W3110與基因工程菌BWOOl的疏水性與自凝集特性分析
[0026] 圖6野生型大腸桿菌W3110與基因工程菌BWOOl的抗生素抗性分析
【具體實施方式】
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