活疫苗制備
【專利說明】活疫苗制備
[0001] 本發明提供了用于生成含有穩定細菌的活疫苗的方法，W及通過所述方法獲得的 含有細菌的疫苗，所述穩定細菌攜帶至少=個減毒突變。
[0002] 活細菌疫苗中的許多包含已通過生物分子技術操作的減毒細菌。不幸的是，出于 下述原因，該些疫苗中的大多數視為不足W順應實踐需要： (a) 生產是復雜和耗時的，減毒程度不能得到控制，并且相應地對宿主敏感性的適應通 常是不能令人滿意的。 (b) 通過立法機構要求的測試方法(臨床試驗）也是復雜的。 (C)待接種疫苗的群體是有限的。
[0003] 相比之下，通過代謝漂移（MD)減毒的突變體的特征在于下述優點： (a) 制備成本很低，并且經由增加的世代時間的所需選擇的減毒程度和因此各自降低 的菌落大小原則上幾乎是任意的。 (b) 當使用具有S個減毒MD突變的穩定特異性疫苗株用于農場動物的疫苗接種時，不 需要精細的測試方法。 (C)將取得甚至更小的批量大小。
[0004] 關于MD減毒的進化原則的關鍵數據，應強調下述： (a) 致病因子相對于宿主的相互影響基于相互耐受。當偶然由高度有毒力的致病因子 的減毒突變體感染時，高度敏感的宿主作為單一個體而存活。宿主群體經由少數存活個體 而恢復活力。致病因子作為適應的減毒株而增殖。多發性粘液瘤病是此類過程的典型例子。 結論；細菌群體及真菌和病毒的群體）始終含有逐漸減毒的突變體，尤其是所謂的MD突 變體。 (b) 根據定義MD突變體代表在代謝區室中具有突變的克隆，導致功能障礙（即減毒= 適合度代價)。因此，可W發現與野生株相比較逐步降低的菌落大小(取決于克隆)。正常地， 該些突變體通過免疫活性宿主消除，或可替代地，被適應的正常菌群生長超過。 (C)MD突變體的菌落大小降低與(延長的）世代時間和(增加的）減毒程度反相關。 (d)MD減毒測試疫苗和疫苗令人信服的功效已得到證明。
[0005] MD突變體可W作為下述選擇且分離： (a) 例如鏈霉素、利福平、磯霉素、夫西地酸、蒙晚酸的自發MD抗生素抗性（MD"res") 克隆。該些克隆可與劇毒抗性克隆有關超過1%的頻率分離。MD"res"和有毒力的抗 性克隆起因于不同突變。相應地，MD"res"和減毒可W視為功能實體。 (b) 在"相繼死亡"培養物中的間接累積的環境應激耐受力（iet)增加的突變體。 (C)衍生自鏈霉素依賴性（Smd)克隆的鏈霉素不依賴性（Sm-id)抑制基因突變體。該 兩種標記突變體由廣譜克隆組成，所述廣譜克隆的特征在于特別的逐漸降低的菌落大小W 及分別從幾乎野生型毒力到過度減毒(微型菌落）的漸增減毒程度的克隆。一般地，核糖體 突變或多或少增加正常錯讀(錯譯)，并且唯一的抑制突變也引起減毒。
[0006]對于例如雞群體用活的沙口氏菌屬（皿we77a)和彎曲桿菌屬（<方聲>_77(9知 疫苗的免疫接種，對人類的感染鏈的中斷和因此人腸炎的降低是主要目標。通常，雞耐受兼 性致病性沙口氏菌屬巧日甚至一般的彎曲桿菌屬)，而不顯示任何臨床癥狀。因此，該些野生 株對于雞的低毒力要求疫苗株顯示中等程度的減毒，一方面確保對于雞的免疫原性，但另 一方面排除對于人類的危害。
[0007] 疫苗株功效的一個標準是例如在攻擊后能證實的建群程度的降低。甚至對于彎曲 桿菌屬，表達細菌的所有組分(例如外膜蛋白質)的MD減毒的活疫苗也可W視為實踐導向選 項。
[0008] 因此，能夠開發用于兼性致病菌例如沙口氏菌屬和彎曲桿菌屬的有效疫苗，條件 是通過調整至低或中等減毒程度來避免過度減毒。換言之，作為減毒等價物的菌落大小降 低不應降至低于野生株菌落大小的約25%。另外，該種必要條件必須與機陽的安全要求一 致；由于存在兩個獨立的減毒突變的穩定性。回復率/標記為約lOA然而，存在開發疫苗 株的需要，所述疫苗株顯示甚至更高的穩定性，即更低的回復率，而不是過度減毒。不幸的 是，引入另外突變W增加活疫苗的安全性通常導致過量減毒，由此致使疫苗較不有效。
[0009] 因此，本發明基礎的技術問題是提供特征在于穩定性增加的改良活疫苗株。所述 技術問題的解決方案通過提供權利要求中表征的實施方案來實現，即提供基于至少=個突 變的穩定性增加的改良活疫苗株，然而避免過度減毒且允許將減毒調整至所需水平。事 實上，在導致本發明的實驗期間，可W顯示通過使用MD減毒，可W生成特征在于S個(或 甚至更多個）獨立減毒突變的疫苗株，其顯示增加的穩定性且減毒程度不超過具有兩個MD "res"減毒突變的疫苗株的減毒程度。在本發明的實驗中使用鏈霉素，然而，本發明中公開 的操作并不僅限于該抗生素。下文描述的實驗基于衍生自Smd突變體的所謂的Sm-id克隆 的使用，因為該些"雙重標記"突變體(包含顯示從野生株樣菌落到微型菌落的所有減毒程 度的克隆）允許生成疫苗株，其顯示的減毒程度對應于MD"res"單一標記株的減毒程度。 本發明的菌株（Sm-id/MD"res")顯示約1(T24的穩定性增加。
[0010] 迄今為止，沙口氏菌屬和彎曲桿菌屬的Sm-id/MD"res"疫苗株在現有技術中仍未 得到描述。另外，通過逐步滲入兩個或S個Sm-id突變和另外的MD"res"(Aa,Aa)標 記而生成的，具有四個、五個或甚至六個減毒突變的疫苗株同樣是新型的，對于鏈霉素：分 別為Smd1 -Sm-idI-Smda-Sm-idII-Sm-a-Sm-idIII(六個減毒突變） 和Sm-id1/Sm-idII/MD"res"(五個減毒突變)。
[0011] 發現具有兩個、四個或六個標記的組合的Sm-id突變體的特定逆轉株譜(逐漸降 低的菌落大小）開始；（a)對于Sm-id菌株，具有野生株的菌落大小，（b)對于Sm-id1/ Sm-idII菌株，具有Sm-idI樣菌落大小的菌落大小，和（C)對于Sm-id1/Sm-idII/ Sm-idIII構建體，發現的最大菌落僅對應于Sm-id1/Sm-idII樣克隆。因此，該些不是 野生株樣逆轉株。
[0012] 原則上，Smd突變體作為用于生成Sm-id克隆的起始菌株的選擇和分離屬于目 前領域發展水平。約10%的例如葡萄球菌屬（如7(9cc(9ci)、大腸桿菌（fecAericAia CO")、蠟狀芽抱桿菌（&?cj77化cere化0的正常Sm抗性突變體菌落是Smd克隆(作為外觀 生物學原則)。然而，該不應用于沙口氏菌屬和彎曲桿菌屬。在顯示抗性的突變體菌落中沙 口氏菌屬的Smd克隆的出現頻率據報道為約0. 1%，或分別地，此類菌株的分離可僅通過使 用誘變來實現。
[0013] 有趣的是，在分析約5000種Sm抗性突變體后，本發明人無法發現任何Smd菌株。 另外，必須強調Sm-id逆轉株的譜取決于Sm克隆而改變，相應地，需要幾個Smd克隆作為起 始突變體。換言之，關于選擇的常見操作是不適用的。
[0014] 因為推測核糖體Smd途徑是適應的進化原則，所W測試兩種可能機制： (a)Smd突變體在其形成后立即進入死亡期。因此，此類突變體只能從對數期培養物中 分離，例如從《18小時/37°C培養物而不是> 48小時/37°C培養物中分離。
[0015] (b)在新生狀態期間，Smd克隆是脆弱的，顯示作為微型菌落(其可能被忽略）的延 遲生長。該些微型菌落適合在傳代期間的"正常生長"。
[0016] 對于彎曲桿菌屬，不存在關于Smd-和Sm-id突變體可用的數據。在文獻中，僅存 在關于Sm抗性突變體的一些提示；顯示高抗性的克隆只能通過使用針對濃度增加的鏈霉 素的多次傳代而獲得。一步Sm抗性只能通過使用20yg鏈霉素/ml的濃度來實現。本發 明人使用100yg鏈霉素/ml用于分離顯示Sm抗性的突變體和Smd突變體的實驗(通過72 小時/39°C培養物的鋪平板）失敗。令人驚訝的是，發現盡管顯著增加的細菌量，但活菌數 從24小時/39°C到72小時/39°C培養物顯著減少，如下表中所示。
[0017] 表 1 結腸彎曲桿菌（Camp^obacter