一種n-乙酰氨基葡萄糖的發酵生產方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及發酵工程領域，具體地說，涉及一種N-乙酰氨基葡萄糖的發酵生產方法。
【背景技術】
[0002]氨基葡萄糖的用途十分廣泛，主要應用于食品、醫療、化妝品、農牧業等領域。目前，氨基葡萄糖最多的被用于關節炎的預防和治療。氨基葡萄糖是結締組織與軟骨細胞的主要成分，如果關節發生病變，補充氨基葡萄糖可以修補受損的軟骨，增加關節間的潤滑。
[0003]現在，我國的氨基葡萄糖大多以殼聚糖為原料生產，但是存在原料來源不穩定，一些人群存在過敏反應等缺點。雖然微生物發酵法生產N-乙酰氨基葡萄糖(在含有N-乙酰氨基葡萄糖的發酵液中，加入0.lmol/L的鹽酸，100°C下反應3h，可以把90%以上的N-乙酰氨基葡萄糖轉化為氨基葡萄糖)可以克服以上缺點，但微生物發酵生產N-乙酰氨基葡萄糖存在產量低、轉化率低和副產物乙酸、谷氨酸含量高的現象，因此，需要開發一種N-乙酰氨基葡萄糖的發酵新工藝，以提高N-乙酰氨基葡萄糖的發酵產量和轉化率，同時降低發酵副產物乙酸、谷氨酸的含量。
【發明內容】
[0004]為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種N-乙酰氨基葡萄糖的發酵生產方法。
[0005]為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下:
[0006]一種N-乙酰氨基葡萄糖的發酵生產方法，在發酵過程中，當發酵液的殘糖含量降至0.5g/L以下時，按照5?8g/L.h的流加速率向發酵液中流加葡萄糖溶液，當發酵液的0D660nm = 28?31時，加入IPTG進行誘導，再按照0.5?0.8g/L *h的流加速率向發酵液中流加尿素溶液。流加尿素時，葡萄糖仍同時流加。
[0007]進一步地，所述尿素溶液的流加速率與葡萄糖溶液的流加速率之比為1:10。
[0008]進一步地，所述IPTG的加入量為0.03mM。
[0009]進一步地，所述葡萄糖溶液的質量濃度為55%。
[0010]進一步地，所述尿素溶液的質量濃度為15%。
[0011]進一步地，所述方法包括以下步驟:
[0012](I)種子培養:
[0013]配制種子培養基，用濃度為25% (m/m)的氨水調種子培養基pH至7.3，向種子培養基中通飽和蒸汽至121°C，保溫30min，設定種子培養條件:溫度37°C，罐壓0.05mpa，通風比1:0.5，轉速300rpm，pH6.8?7.0 ;接入產N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌進行培養，當種子0D660nm = 3.5?5范圍區間時，作為種子成熟標準；
[0014](2)發酵培養:
[0015]配制發酵培養基，121°C，滅菌30min，降溫后設定發酵培養條件:溫度37°C，罐壓0.03?0.05mpa，通風比1: 0.5?1: 1，轉速300?500rpm，pH全程用25% (m/m)氛水自控為6.9?7.0 ;將成熟的N-乙酰氨基葡萄糖種子液按照10% (V/V)接種量接種到發酵罐進行培養，發酵過程中通過調節罐壓、風量、轉速控制溶氧30-40% ;
[0016]當發酵液的殘糖含量降至0.5g/L以下時，按照5?8g/L-h的流加速率向發酵液中流加葡萄糖溶液，當發酵液的0D660nm = 28?31時，加入IPTG進行誘導，再按照0.5?0.8g/L.h的流加速率向發酵液中流加尿素溶液；培養52?56小時。
[0017]進一步地，所述種子培養基為:葡萄糖15g/L (單消)，磷酸氫二鉀I lg/L，磷酸二氫鉀16g/L，酵母浸粉lg/L，蘇氨酸0.2g/L，蛋氨酸0.15g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸錢5g/L，硫酸錳 0.013mg/L,硫酸鐵 0.024mg/L,硫酸鋅 0.047mg/L,氯化鈷 0.01mg/L。
[0018]進一步地，所述發酵培養基為:葡萄糖5g/L(單消)，磷酸氫二鉀16g/L，磷酸二氫鉀10g/L，酵母浸粉0.3g/L，酵母膏0.lg/L,蘇氨酸0.lg/L,蛋氨酸0.15g/L，硫酸鎂0.25g/L，硫酸錢3g/L，氯化鉀0.lg/L，硫酸猛0.015mg/L，硫酸鐵0.35mg/L，硫酸鋅0.41mg/L，氯化鈷 0.02mg/L。
[0019]作為優選，流加尿素溶液后，培養54小時。
[0020]本發明的有益效果在于:
[0021]本發明提供的N-乙酰氨基葡萄糖的發酵生產方法，在發酵過程通過IPTG進行誘導，并優化了誘導時葡萄糖溶液和尿素溶液的流加速率，顯著提高發酵終點N-乙酰氨基葡萄糖含量和轉化率。
【具體實施方式】
[0022]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0023]在下述實施例和對比例中:
[0024]OD值測定:采用7230G可見分光光度計，在波長660nm可見光下測定吸光值。
[0025]按照GB/T5009.7-2008的方法測定還原糖的濃度。
[0026]N-乙酰氨基葡萄糖含量測定:高效液相色譜法。
[0027]乙酸含量測定:高效液相色譜法。
[0028]谷氨酸含量測定:取發酵液離心后的上清液，稀釋到殘谷氨酸濃度在lg/L以內，用生物傳感分析儀測定。
[0029]轉化率(％ ) =N-乙酰氨基葡萄糖量/總耗糖量X 100%。
[0030]實施例1
[0031](I)配制種子培養基:葡萄糖15g/L，磷酸氫二鉀llg/L，磷酸二氫鉀16g/L，酵母浸粉lg/L，蘇氨酸0.2g/L,蛋氨酸0.15g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸銨5g/L，硫酸錳0.013mg/L，硫酸鐵 0.024mg/L，硫酸鋅 0.047mg/L，氯化鈷 0.01mg/L。
[0032]投入到50L發酵罐中，用濃度為25% (m/m)的氨水調種子培養基pH至7.3，向種子培養基中通飽和蒸汽至121°C，保溫30min，設定種子培養條件:溫度37°C，罐壓0.05mpa,通風比1:0.5，轉速300rpm，pH6.8-7.0。接入產N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌進行培養，當種子0D660nm = 3.5-5范圍區間時，作為種子成熟標準。
[0033](2)配制發酵培養基:葡萄糖5g/L(單消)，磷酸氫二鉀16g/L，磷酸二氫鉀1g/L，酵母浸粉0.3g/L，酵母膏0.lg/L,蘇氨酸0.lg/L,蛋氨酸0.15g/L，硫酸鎂0.25g/L，硫酸錢3g/L，氯化鉀0.lg/L,硫酸猛0.015mg/L,硫酸鐵0.35mg/L，硫酸鋅0.41mg/L，氯化鈷0.02mg/Lo
[0034]投入到50L發酵罐中，121°C，滅菌30min，降溫后設定發酵培養條件:溫度37°C，罐壓 0.03-0.05mpa，通風比 1: 0.5-1:1，轉速 300_500rpm，pH 全程用 25 % (m/m)自控為 7.0。將成熟的N-乙酰氨基葡萄糖種子液按照10% (V/V)接種量接種到發酵罐進行培養，發酵過程中通過調節罐壓、風量、轉速控制溶氧30-40%。
[0035]當N-乙酰氨基葡萄糖發酵培養過程中殘糖降至0.5g/L以下時，按照5g/L.h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖發酵液中流加55% (m/m)葡萄糖溶液。
[0036]當N-乙酰氨基葡萄糖發酵液0D660nm = 28-31區間時，一次性加入0.03mM IPTG進行誘導，此時按照葡萄糖溶液與尿素溶液質量比10:1的速率流加尿素溶液，即按照流加速率0.5g/L.h向N-乙酰氨基葡萄糖發酵液中流加15% (m/m)尿素溶液。
[0037]本發明根據發酵后期不產N-乙酰氨基葡萄糖或者產N-乙酰氨基葡萄糖較慢來判斷發酵終點，發酵培養周期54小時，N-乙酰氨基葡萄糖含量為107g/L，轉化率為38.3%,乙酸含量為3.9g/L，谷氨酸含量為5.7g/L。
[0038]實施例2
[0039]當N-乙酰氨基葡萄糖發酵培養過程中殘糖降至0.5g/L以下時，按照6g/L.h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖發酵液中流加55% (m/m)葡萄糖溶液。此時按照葡萄糖溶液與尿素溶液質量比10:1的速率流加尿素溶液，即按照流加速率0.6g/L.h向N-乙酰氨基葡萄糖發酵液中流加15% (m/m)尿素溶液。其他條件與培養方法同實施例1。發酵培養54h時，N-乙酰氨基葡萄糖含量為110g/L，轉化率為40.1%，乙酸含量為1.9g/L，谷氨酸含量為 2.lg/L ο
[0040]實施例3
[0041]當N-乙酰氨基葡萄糖發酵培養過程中殘糖降至0.5g/L以下時，按照7g/L.h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖發酵液中流加55% (m/m)葡萄糖溶液。此時按照葡萄糖溶液與尿素溶液質量比10:1的速率流加尿素溶液，即按照流加速率0.7g/L.h向N-乙酰氨基葡萄糖發酵液中流加15% (m/m)尿素溶液。其他條件與培養方法同實施例1。發酵培養54h時，N-乙酰氨基葡萄糖含量為98g/L，轉化率為38.5%，乙酸含量為3.2g/L，谷氨酸含量為 3.5g/Lo
[0042]實施例4
[0043]當N-乙酰氨基葡萄糖發酵培養過程中殘糖降至0.5g/L以下時，按照8g/L.h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖發酵液中流加55% (m/m)葡萄糖溶液。此時按照葡萄糖溶液與尿素溶液質量比10:1的速率流加尿素溶液，即按照流加速率0.8g/L.h向N-乙酰氨基葡萄糖發酵液中流加15% (m/m)尿素溶液。其他條件與培養方法同實施例1。發酵培養54h時，N