檢測土壤中10種常見病原微生物的基因液相芯片及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種檢測±壤中10種常見病原微生物的基因液相巧片及其制備方 法。本發明還設計利用所述的基因液相巧片進行檢測的方法。
【背景技術】
[0002] 液相巧片，也稱為微球體懸浮巧片（suspensionarray,liquidchip),是基于 xMAP技術的新型生物巧片技術平臺，它是在不同編碼的微球上進行抗原-抗體、酶-底物、 配體-受體的結合反應及核酸雜交反應，通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和報告巧 光來達到定性和定量的目的，一個反應孔內可W完成多達100種不同的生物學反應，是繼 基因巧片、蛋白巧片之后的新一代高通量分子檢測技術平臺。迄今為止十年時間，全球已有 數百套基于xMAP技術的檢測平臺用于免疫性、蛋白質、核酸就愛南側、基因研究等領域，該 技術已經成為一種新的蛋白質組學和基因組學研究工具，也是最早通過美國食品與藥物管 理局（抑A)認證的可用于臨床診斷的生物巧片技術。
[0003] 利用液相巧片檢測時，先后加入樣品和報告分子與標記微球反應，樣品中的目的 分子能夠與探針和報告分子特異性結合，使交聯探針的微球攜帶上報告分子藻紅蛋白，隨 后利用儀器巧日Luminex100)對微球進行檢測和結果分析。Luminex100采用微流技術使 微球快速單列通過檢測通道，并使用紅色和綠色兩種激光分別對單個微球上的分類巧光和 報告分子上的報告巧光進行檢測。紅色激光可將微球分類，從而鑒定各個不同的反應類型 (即定性);綠色激光可確定微球上結合的報告巧光分子的數量，從而確定微球上結合的目的 分子的數量（即定量)。因此，通過紅綠雙色激光的同時檢測，完成對反應的實時、定性和定 量分析。
[0004] ±壤生物污染（biological pollution of soil),指病原體和帶病等有害生物種 群從外界入侵上壤，破壞上壤生態系統的平衡，引起上壤質量下降的現象。有害生物種群 來源主要是用未經處理的人畜糞便施肥，生活污水、垃圾、醫院含有病原體的污水和工業廢 水，W及病畜尸體處理不當等。通過上述主要途徑把含有大量傳染性細菌、病毒、蟲卵帶入 ±壤，進而引起人體患有各種細菌性和病毒性疾病，威脅人類生存。
[0005] 目前，對環境中微生物特定種群的檢測主要方法有；磯脂脂肪酸法（PLFA)、 real-timePCR、核糖體DNA限制性酶切分析（A畑RA)、核糖體基因間的間隔分析（RISA)、巧 光原位雜交（FISH)、穩定同位素探針（SIP)和固相基因巧片技術。
【發明內容】
[0006] 本發明首次實現了利用液相巧片技術對±壤環境中常見致病菌的檢測，也彌補了 現有技術對±壤微生物分離鑒定的不足，該發明提供了一種能夠對±壤中常見致病菌進行 識別和監控的利用液相巧片技術檢測環境致病菌的方法，該方法利用液相巧片技術建立了 一個可識別±壤中的馬紅球菌、糞產堿桿菌、奇異變形桿菌、蠟樣芽抱桿菌、小腸結腸耶爾 森菌、豬鏈球菌、藤黃微球菌、黑曲霉、黃曲霉、煙曲霉的監測系統。
[0007]本發明是通過如下技術方案實現的： 一種檢測±壤中10種常見致病菌的核巧酸，其特征在于所述的核巧酸具有；SEQID NO: 1-30所示的核巧酸。
[0008]本發明進一步公開了采用上述核巧酸檢測±壤中10種常見致病菌的方法，其特 征在于；包括如下步驟： (1) 借助生物信息學知識和相關生物信息學軟件，對NCBI中能夠檢索到的所有馬紅球 菌、糞產堿桿菌、奇異變形桿菌、蠟樣芽抱桿菌、小腸結腸耶爾森菌、豬鏈球菌、藤黃微球菌 的16SrDNA~23SrDNA間區序列和黑曲霉、黃曲霉、煙曲霉的18SrDNA~28SrDNA間區序列 進行同源性分析，找出保守區域，設計出針對各自基因片段的特異性探針和引物； (2) 采用多重PCR與一步不對稱PCR技術相結合的PCR方法，多重PCR即將十種菌分為 A/B兩組，每組各含五種菌，PCR時，五對引物混合可W同時對五個相應模板進行同時擴增； 一步不對稱PCR即要求PCR擴增中加入的上、下游引物量不同，W致PCR產物大多數為單鏈 產物，同時保證PCR產物片段大小，W利于同單鏈特異探針進行雜交，提高雜交信號強度； (3) 特異性探針的5'端進行C12和氨基化修飾，與巧光編碼的微球進行偶聯；將PCR擴 增產物與偶聯有特異性探針的微球混合液溫育雜交，SA-PE染色，最后用Luminex100進行 檢測； (4) 由（1)- (3)所建立的液相巧片檢測體系，設及一種檢測試劑盒的開發，該檢測試 劑盒包括W上全部步驟。
[0009]本發明更進一步公開了檢測±壤中10種常見致病菌的核巧酸在識別±壤中的馬 紅球菌、糞產堿桿菌、奇異變形桿菌、蠟樣芽抱桿菌、小腸結腸耶爾森菌、豬鏈球菌、藤黃微 球菌、黑曲霉、黃曲霉、煙曲霉中的應用。實驗結果表明；糞產堿桿菌的檢測靈敏度為1pg/ ul、蠟樣芽抱桿菌為10fg/ul、豬鏈球菌為100fg/ul、小腸結腸耶爾森菌為100pg/ul、藤 黃微球菌為100fg/ul、馬紅球菌為10fg/ul、奇異變形桿菌為100pg/ul、黑曲霉為10fg/ ul、黃曲霉為100fg/ul、煙曲霉為10pg/ul。巧片檢測靈敏度極高，fg數量極的樣本基因 組經PCR擴增后都能通過液相巧片檢測出來(適當的變化一下說法，已和后面的結論。
[0010] 本發明檢的測方法具有較高的特異性和靈敏度，并且檢測快速，能夠對±壤中的 致病菌進行識別和監控。由上述的技術方案可見，本發明首次將液相巧片技術引入±壤中 常見致病菌檢測領域，建立了一種快速、靈敏、準確性高、重復性強的±壤中常見致病菌檢 測液相巧片及其檢測方法，利用本發明的液相巧片可W達到檢測±壤中常見的致病菌的目 的，由于操作簡便，準確性高，重復性強，環保部口對±壤中致病菌的實時監測具有重要的 應用價值。
[0011]
【附圖說明】： 圖1巧片特異性檢測實驗結果； 圖2A組任意四種菌同時檢測實驗結果； 圖3藤黃微球菌靈敏度檢測實驗結果； 圖注；A組中A、B、C、D、E分別代表糞產堿桿菌、蠟樣芽抱桿菌、黑曲霉、煙曲霉、馬紅球 菌，*11等代表微球編號。
[0012]
【具體實施方式】
[0013] 為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下面特舉較佳實施例， 并配合說明書附圖，作詳細說明如下。
[0014] 實施例1 引物、探針的設計于制備 1、 探針的篩選 特異性探針是整個液相巧片技術核屯、部分，一般采用先設計特異性探針，然后再根據 探針位置來設計相應的引物。
[0015] 由于后期多重PCR的要求，因此在前期設計探針時，應注重保證所有探針Tm值在 一定范圍內，本研究選取Tm值范圍在55+2°C。設計探針時將探針的長度控制在25-35bp之 間，GC含量控制在30-60%。前期設計時針對每一個祀基因設計了多條特異探針該樣不僅保 證可W篩選出即保守又特異的探針，還能更加確保檢測結果的可靠性。
[0016] 要想得到既保守又特異的探針如果僅僅靠生物信息學分析是遠遠不夠的，有時候 很符合上述條件的探針在實際雜交過程中卻得不到穩定的陽性信號。因此設計好的探針必 須經過實際巧片上機檢測進行反復的篩選，才能保證真正有效地探針。
[0017] 本研究經過反復多次的實驗篩選，最終獲得了每種菌特異的探針序列，如表1所 示： 表1本發明基因巧片上選用的寡核巧酸探針序列及可檢測出的致病菌
2、 引物的設計 通過閱讀大量文獻，本研究最終確定W細菌及真菌間區基因為祀基因。利用Primer Premier5. 0設計引物，設定好引物的長度、引物類型、堿基數目等參數后運行軟件，從輸出 結果中找出Tm值=50°C±5°C、堿基數在18-30bp之間、引物間無二聚體、引物內部無二級 結構且擴增片段包含探針序列的引物。并且最終要保證所有引物PCR擴增出來的目的片段 在100~300bp之間。利用設計好的引物多重PCR，最終得到的引物如表2所示： 表2巧片所用到的引物
實施例2、基因液相巧片的制備 (1) 選取編碼微球（bio-rad或Luminex公司），每一條探針對應一個微球編號，10種病 原微生物的10條探針就需要10個不同的微球編號，如007號微球偶聯糞產堿桿菌的探針， 取約1. 25X106個置于離屯、管，12000iDm/min，離屯、3-5分鐘，小屯、移去上清； (2) 加入10uL0. 1M的2- (n-嗎咐代）己橫酸溶液，充分震蕩混勻，稍微離屯、； (3) 用蒸饋水將合成的寡核巧酸探針稀釋至0.Immol/L;加入4uL稀釋糞產堿桿菌探針 與007號微球懸浮液中，振蕩混勻； (4) 加入2. 5化新鮮配制的lOmg/血的邸C溶液至微球與探針混合液中，振蕩，室溫避 光解育30分鐘； (5) 重復步驟4; (6) 用 1 血 0. 02%Tween20 洗漆一次，12000;rpm/min離屯、3-5 分鐘； (7) 小屯、棄上清，微球重懸于1mL0. 1%SDS中，振蕩混勻； (8) 12000巧m/min離屯、3-5分鐘，小屯、棄上清，微球重懸于30uLP服.0TE中，振蕩懸 起混勻，即得到偶聯好的檢測微球； (9) 用血球計數器計數微球的數量，換算出每種微球的單位濃度； (10) 把偶聯好的檢測微球放在4°C避光保存，每種探針偶聯的微球單獨保存，使用時， 根據檢測項目選擇要混合的微球種類。
[001引實施例3、樣本核酸的提取 (1)取1.5血菌液離屯、管中，8000巧m離屯、5分鐘，棄上清，重復洗一次。
[0019] (2)加入 250uL50mlTris-HCl緩沖液（pH8. 0)重懸，12000 巧111離屯、5 分鐘， 棄上清。
[0020] (3)加入 250uL50mlTris-HCl緩沖液（pH8. 0)重懸，再加 10uL0. 45M 邸TA(pH8.