一種快速鑒定恙蟲病立克次體的lamp引物組、試劑盒及方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及病原微生物的檢測與鑒定，具體設及一種用環介導等溫基因擴增技術 (LAMP技術）快速鑒定恙蟲病立克次體的方法。
【背景技術】
[0002] 恙蟲病，又稱為叢林斑疹傷寒，是由恙蟲病立克次體導致的疾病，是中國最早發現 的感染性疾病之一。恙蟲病立克次體呈短桿狀，平均長度1.2um，常見成雙排列，寄居于恙 蛾，并可經卵傳代。恙蛾幼蟲需吸取人或動物的淋己液或血液完成從幼蟲到稚蟲的發育過 括，町嗦機體后可引起畏窠、發熱、町嗦化有焦硫或饋瘍、淋己結腫大、結腸充血、巧疼等臨 床癥狀。恙蟲病廣泛流行于我國，根據流行時間，可分為夏季型和秋冬型。夏季型主要分布 于南方廣東、廣西、海南等省份，秋冬型主要流行于江蘇、山東等地。恙蟲病為散發性的自然 疫源性疾病，自1986年W來，恙蟲病由主要在南方流行呈現逐漸向北方擴增的流行態勢。
[0003] 恙蟲病感染者早期的臨床癥狀與登革熱、追疾、傷寒等熱帶病極為相似。目前針 對恙蟲病的病原培養性檢測比較困難，常規的血清學分型又有檢測耗時長且特異性、靈敏 性差等缺點。巧光PCR等核酸檢測方法，雖然提高了檢測的靈敏度和特異性，但需要昂 貴的儀器設備。W上各種方法雖然可能在臨床上提供較好的診斷價值，但由于其各自的 缺點未能在臨床上大規模使用。環介導等溫基因擴增技術化oop-MediatedIsothermal Amplification,LAMP)是日本榮研化學株式會社于2000年前后開發出的基因擴增技術，具 有快速簡便、操作準確、容易普及、安全可靠的優點，目前尚未有將LAMP法應用于快速鑒定 恙蟲病立克次體。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一組用于快速檢測恙蟲病立克次體的特異性引物，及一種 用環介導等溫基因擴增技術（LAMP技術）快速鑒定恙蟲病立克次體的方法。本鑒定方法方 便快捷、價格低廉，適于推廣應用。
[0005] 為達到上述目的，本發明所采用的技術方案如下： 用于快速鑒定恙蟲病立克次體的特異性引物組，其特征在于，包括： 內引物 1 ;5, -TTGCTACACCAAGTGCTCCTGATATGCTGGTCTTGGTGC-3，（沈QIDNo. 1); 內引物 2:5，-TTAATGCTGCTGAGGGTGTGTCGCATTTACCGAGTACTTATCT-3，（沈QIDNo. 2); 外引物 1 ;5' -TTGATCTGAGTATGATTGTCGG-3'（SEQIDNo. 3); 外引物 2 ;5, -GAAGTTATAGCGTACACCTACA-3'（SEQIDNo. 4); 環引物 1 ;5, -GCAACCATACCTGTATGCC-3'（沈QIDNo. 5); 環引物 2 ;5' -ATGTGGACATAGAAGGTGGTT-3'（沈QIDNo.6)。
[0006] -種用于快速鑒定恙蟲病立克次體的RT-LAMP試劑盒，其含有上述的RT-LAMP特 異性引物組。
[0007] 所述引物組中，內引物、外引物、環引物的摩爾比為8 ;1 ;4。
[0008] 所述用于快速鑒定恙蟲病立克次體的RT-LAMP試劑盒還包括W下成分；逆轉錄 酶；（3)DNA聚合酶；RT-LAMP反應液；顯色劑；陽性對照和陰性對照。
[0009] 所述逆轉錄酶為^必鵬轉錄酶；所述DNA聚合酶為化^DNA聚合酶。
[0010] 所述RT-LAMP反應液含有；lOmMdNTP、10XIliermo化 1 反應緩沖液、150mMM拆〇4、 5mM甜菜堿，四者的體積比為6~8 ;4~5 ;2~3 ;8~10。
[0011] 所述顯示劑為SYBRGREENI。
[0012] 所述陽性對照為含有恙蟲病立克次體保守序列的基因片段（SEQIDNO. 7)的質 粒，陰性對照為DEPC水。
[0013] 一種快速鑒定恙蟲病立克次體的方法，具體包括如下步驟： (1) 提取模板RNA; (2) 利用上述特異性引物組對模板RNA進行環介導等溫基因擴增反應； (3) 結果判斷；在上述反應管中加入2化顯色劑10XSYBRGREENI，混勻后觀察反應 液的顏色，若呈現綠色則為恙蟲病立克次體，澄色則為非恙蟲病立克次體。
[0014] 環介導等溫基因擴增反應的25化反應體系含有；內引物1、2各8pmol/化，外弓I 物1、2各1pmol/ML，環引物1、2各4pmol/ML，反應液12. 5ML，DNA聚合酶8U，待檢RNA 1~l(K)ng，逆轉錄酶1U，用滅菌去離子水補齊到25化；環介導等溫基因擴增反應的條件為： 60 ~65°C反應 30 ~40min。
[0015] 本發明的有益效果在于；本發明針對恙蟲病立克次體TSA56區域特異性設計了 6 條引物，與目的基因的6個區域結合，具有較高的特異性。本發明的試劑盒方便快捷，能在 較短的時間內鑒定恙蟲病立克次體，且不需要昂貴的儀器設備；靈敏度高；特異性好，適合 現場檢測。
【附圖說明】
[001引圖1為本發明RT-LAMP試劑盒的陰性與陽性對照品的檢測結果（一;陰性對照，+: 陽性對照）； 圖2為本發明對恙蟲病立克次體W及對非恙蟲病立克次體的擴增結果（一:陰性樣 品，+;陽性樣品，1;非恙蟲病立克次體樣本，2;恙蟲病立克次體樣品） 圖3為實施例2的特異性驗證結果（1;陰性，2 ;0.Tsutsugamushi，3 ;I?ickettsia prowazekii，4;Rickettsiamooseri，5;Rickettsiarickettsii，6 ;YFV，7 ;JEV，8 ;HSV，9; EBV,10；DENV2 )； 圖4為實施例3的靈敏度實驗結果（a;普通PCR擴增結果，b:Real-timePCR擴增結 果，c:本發明RT-LAMP擴增的凝膠電泳結果，d:本發明RT-LAMP擴增的Real-time結果， e:本發明RT-LAMP擴增的顯色結果1 :DEPC，2~8:含有恙蟲病立克次體特異性TSA56基 因 1. 0、1.OXl0i、l.OXl02、l. 0Xl03、l. 0Xl04、l. 0Xl05、l. 0Xl06 拷貝 /化）。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0018] 實施例1用于快速鑒定恙蟲病立克次體的RT-LAMP試劑盒的建立 用于快速鑒定恙蟲病立克次體的RT-LAMP試劑盒，包括W下成分；（1)特異性引物組； (2)逆轉錄酶；（3)DNA聚合酶；（4)RT-LAMP反應液；（5)顯色劑；（6)陽性對照和陰性對 照。
[0019] (1)特異性引物的設計： 根據恙蟲病立克次體（GenBank登錄號為；GU446621. 1)的特異性區域設計6條特異性 引物，序列分別如下： 內引物 1 ;5, -TTGCTACACCAAGTGCTCCTGATATGCTGGTCTTGGTGC-3，（沈QIDNo. 1); 內引物 2:5，-TTAATGCTGCTGAGGGTGTGTCGCATTTACCGAGTACTTATCT-3，（沈QIDNo. 2); 外引物 1 ;5' -TTGATCTGAGTATGATTGTCGG-3'（SEQIDNo. 3); 外引物 2 ;5, -GAAGTTATAGCGTACACCTACA-3'（SEQIDNo. 4); 環引物 1 ;5, -GCAACCATACCTGTATGCC-3'（沈QIDNo. 5); 環引物 2 ;5' -ATGTGGACATAGAAGGTGGTT-3'（沈QIDNo. 6); (2) 逆轉錄酶為化逆轉錄酶； (3) DNA聚合酶為化^DNA聚合酶； (4)RT-LAMP反應液含有；lOmMdNTPJOXIliermoPol反應緩沖液、150mMM拆〇4、5mM甜 菜堿，四者的體積比為8 ;5 ;3 ;10。
[0020] (5)顯示劑為SYBRGREENI。
[0021] (6)陽性對照為含有恙蟲病立克次體基因片段（SEQIDNO. 7)的PMD-19T質粒巧U 用常規的質粒構建方法將SEQIDNO. 7插入PMD-19T質粒中得到）。陰性對照為DEPC水。
[0022] 陽性對照和陰性對照的擴增結果見圖1。
[0023] 實施例2恙蟲病立克次體的檢測方法 (1)提取模板RNA。
[0024] (2)利用實施例1的特異性引物組對模板RNA進行環介導等溫基因擴增反應： 25化反應體系含有；內引物1、2終濃度各為8pmol/ML，外引物1、2終濃度各為1pmol/ 化，環引物1、2終濃度各為4pmol/化，反應液