一種新型黃瓜snp分子標記的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物領域，具體設及一種新型黃瓜SNP分子標記。
【背景技術】
[0002] 黃瓜白粉病是一種廣泛發生的世界性病害，是黃瓜主要葉部病害之一。其潛育期 短、流行性強、周年發生，嚴重影響黃瓜產量與品質。目前，黃瓜白粉病的主要防治措施是化 學防治，但產品農藥殘留量是不可忽視的安全問題，特別是利用設施栽培后，黃瓜生產的連 作障礙問題越來越嚴重。因此，選育抗病品種仍是從根本上防治白粉病的有效途徑。
[0003] 分子標記技術的出現使人們對于基因的準確檢測、目標基因的準確轉移成為現 實。研究者們利用AFLP、SSR等分子標記技術，對抗病基因進行了初步的定位，但抗病基因 與分子標記的遺傳距離普遍較遠，說明黃瓜白粉病抗性分子機理非常復雜，更多科學問題 有待于研究和探索，充分挖掘和利用該些抗性基因，將豐富黃瓜白粉病抗性育種中的抗性 基因資源，并為黃瓜白粉病抗性育種中導入優良抗性基因提供重要基礎。
[0004]SLAF-seq(^specificlengthamplifiedfra卵entsequencing)技術是由高通量 測序技術發展而來。通過生物信息學進行實驗方案系統設計，構建SLAF-seq文庫，篩選特 異長度DNA片段，W高通量測序技術獲得海量序列，利用軟件進行數據分析比對，獲得大量 特異DNA片段，進而依據其序列發展出特異分子標記。SLAF-seq技術具有通量高、準確性 高、成本低、周期短等突出優勢，依其測序結果可直接開發大量特異分子標記。該技術可用 于單體型圖譜、遺傳圖譜、關聯性圖譜、多態性圖譜的構建，為分子育種、系統進化、種質資 源鑒定提供重要技術保障。本發明利用SLAF-seq技術開發了一批特異性強、穩定性高的黃 瓜白粉病抗性特異分子標記，為育種中導入抗性優良基因進行分子標記輔助選擇提供重要 基礎。
【發明內容】
[0005] 為解決上述問題，本發明提供了一種新型黃瓜SNP分子標記，為探索黃瓜白粉病 抗病機理和分子標記輔助選擇育種提供了理論依據。
[0006] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：
[0007] -種新型黃瓜SNP分子標記，所述分子標記的標號為SLAF7695,其核巧酸序列為
[0009] 本發明具有W下有益效果：
[0010] 有助于黃瓜白粉病抗性基因定位，為黃瓜白粉病抗性育種中的分子標記輔助選擇 提供依據。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發明實施例新型黃瓜SNP分子標記的核巧酸序列表。
[0012]圖2為本發明實施例中SLAF標簽在染色體上的分布圖。
[0013] 圖3為本發明實施例中第1染色體上深度分布圖。
[0014]圖4為本發明實施例中多態性標記在各染色體上的分布圖。
[0015] 圖5為本發明實施例中差異標記在各染色體上的分布圖。
[0016]圖6為本發明實施例中第1染色體上差異比值整體分布圖。
[0017] 圖7為本發明實施例中第1染色體差異標記遺傳圖。
【具體實施方式】
[001引為了使本發明的目的及優點更加清楚明白，W下結合實施例對本發明進行進一步 詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用W解釋本發明，并不用于限定本發 明。
[0019] 圖1為本發明實施例中分子標記的核巧酸序列表，其中兩對引物分別是：
[0020] F； 5'ATGGAGACGACATTGGAAACG3' 580
[0021] R； 5'ATGGAAAAGTGAGTCCGTGA3' 1367
[0022] 本發明實施例中W抗病材料BK2為父本、感病材料H136為母本，根據其接種白粉 病后的抗/感表現，利用BSA法在前期構建的F2群體中，挑取50個抗白粉病和感白粉病的 家系組成抗/感白粉病池。材料均種植于浙江省農業科學院楊渡試驗基地。將親本BK2、 化36及F2群體株系在可調控溫度、濕度的智能溫室內盆栽。于黃瓜幼苗一葉一屯、期，采用 噴霧接種法，接種濃度為1X104-1X1〇6個抱子/ml。接種后每S天觀察、記錄一次發病情 況，共記錄15天。然后根據抗/感白粉病的表現型結果，挑取高抗和高感的家系各50個組 成抗/感白粉病池。
[002引實施例
[0024] 取兩葉一屯、期的材料嫩葉，采用改良的SDS法提取其基因組DM,稀釋至60ng/ y心經1%瓊脂糖電泳檢測濃度。利用酶切預測軟件SLAF_Predict系統分析黃瓜基因組， 根據其GC含量、重復序列和基因特點等確定酶切方案、切膠范圍及測序量，W保證分子標 記的密度和均勻性。
[00巧]分別取基因組DNA各500ng，加0.抓Mse I(肥B，Hitchin，Hei~ts，UK)、T4DNA連 接酶（肥B)、ATP(肥B)和Mse I接頭（肥B)在37°C下反應15h，65°C退火比，然后加限制性 內切酶Hae III和Bfa I在37°C下反應化。反應結束后用如ick Spin column(Qiagen) 純化酶切產物，并用33yL邸回溶。W回收的酶切產物為模板進行PCR反應，反應體 系25yL，包括模板DNA 100ng、10Xbuffer 2. 5yL、2. 5mmol/L、dNTP 2yL、5U/yL的 Taq DM合成酶（肥B)0. 3yL、10ymol/L Msel引物2yL、d地20加至25yL。PCR產物經 E. Z. N.A.切cle Pure Kit(Omega)純化后，加入Mse I、T4 DM連接酶、ATP及Solexa接頭， 37°C下反應化。利用Quick Spin Column Qiagen)純化產物，2%瓊脂糖膠電泳。利用Gel Extraction Kit (Qiagen)回收瓊脂糖膠中230-250bp的條帶，并W其為模板，在含化usion Master Mix(肥B)和Solexa引物混合物中進行PCR擴增，擴增產物經純化后用Illumina GAIIx(mumina，San Diego, CA，USA)測序。
[0026] 每個樣品的測序有效數據量需達到50, 000個W上，測序深度5XW上。利用軟件 SLAF_Poly.pi.對測序結果進行識別和低質量過濾，得到有效原始DNA序列數據，再利用比 對軟件BLAT將各樣品有效數據分別進行相似度聚類，并通過深度識別，糾正測序錯誤，得 到各樣品有效序列。
[0027] 參考基因組為黃瓜參考基因組，基因組組裝為染色體，基因組經酶切處理打斷為 多個小片段，每個片段相當于一個標記位點，同一位點reads序列通過相似性聚類，形成一 個group;group中高深度片段即為潛在基因型，低深度片段可能是測序錯誤，通過糾錯策 略對低深度片段進行糾正，最終獲得具有1個或多個等位基因的SLAF標簽。根據SLAF標 簽的基因組定位結果，統計SLAF標簽在各染色體上的數量，繪制SLAF標簽在染色體上的分 布圖。
[002引對得到的SLAF標簽，根據等位基因數和基因序列之間的差異進行多態性分析，獲 得多態性標記的類型和數量，對獲得的多態性標記根據定位結果，統計其在各染色體上的 分布情況。
[0029] 對獲得的多態性標記進行親本數據標準化，根據親本測序深度確定等位基因的親 本來源，選取一種基因型來源于P(H136)，另一種基因型來源于M炬K2)的多態性標記。分別 計算兩個群體aa、油（感池、抗池）中來源于不同基因型的差異比值（Ratio),根據Ratio_ aa> = 1與Ratio_ab> = 3篩選差異標記，獲得差異標記及其在染色體上的數量分布。
[0030] 差異比值計算方法如下：
[0031]Maa表示aa群體來源于M的深度；Paa表示aa群體來源于P的深度；Mab表示油 體來源于M的深度；Pab表示ab群體來源于P的深度；
[0032]Ratio_aa=化a/Maa;當Maa= 0 時Ratio_aa= 1000 ;Ratio_ab=Mab/P油；當 P油=0 時Ratio_ab= 1000。
[0033] 結果與分析
[0034] 采用SLAF-seq技術，獲得父本服2、母本化36及抗/感白粉病池的原始序列。經 測序共獲得各樣品的有效reads為16, 977, 114條，4個樣品的Reads數分別達3, 293, 311、 4, 517, 307、5, 073, 477和4, 093, 019,達到預期目標。Reads長度、數量和GC含量的統計結 果見表1。
[0035] 表1樣品數據量統計
[0036]
[0037]表中；Sample;樣品編號；BMK-ID;樣品；Readlength;使用的read長度；Read number;各樣品的reads數；GCpercentage;GC含量。
[0038] 測序得到的有效SLAF片段，其DM序列經與黃瓜基因組序列進行比對，獲得有效 的SLAF標簽數量為73, 100個，整體平均深度為99. 1IX。
[0039] 根據SLAF標簽的基因組定位結果，SLAF標簽在各染色體上的數量分別為11