一種改良ctab法提取頭花蓼dna的制作方法
【技術領域】
[000。 本發明設及一種DNA提取方法，尤其設及一種改良CTAB法提取頭花寥DNA。
【背景技術】
[0002] 目前，對頭花寥的研究主要在其化學成分及藥理作用、臨床應用、顯微鑒別和栽培 技術等方面。不同研究小組對不同產地野生與栽培頭花寥中的總黃酬含量進行比較發現存 在一定的差異，提示生長環境對藥材質量有影響。近幾年隨著頭花寥在市場價值中的提高， 對頭花寥分子生物學方面的研究也逐漸進入熱點階段。隨著人們對藥品質量的關注，為保 證中藥藥品質量，利用現代分子生物學DNA條形碼技術對貴州道地苗藥頭花寥進行鑒定、 分析研究是目前研究的熱點。
[0003] 但目前傳統的頭花寥DNA提取方法仍然存在如下問題；提取過程復雜、成本高昂、 周期長、純度低，導致引物不具有標準性等問題。
[0004]
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是提供一種方法簡單、成本低廉、周期短，提取的頭花 寥DNA純度更高的頭花寥DNA提取方法。
[0006] 本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種改良CTAB法提取頭花寥DNA，包 括如下步驟： 取材料，用液氮研成粉末，移入離屯、管，加入CTAB提取緩沖液，充分搖勻，并進行水浴、 離屯、； 取上清液，加入等體積的氯仿、異戊醇，取上清轉移至另一離屯、管中，再次取上清液用 氯仿、異戊醇抽提； 將上清加入NaAc、異丙醇，輕輕顛倒混勻、離屯、，棄去上清液，用70%己醇洗漆沉淀、離 屯、，用小槍頭吸干己醇，風干； 去除沉淀中的己醇，用含RNA酶的TE溶解、消化至RNA完全裂解； 分別用等體積的苯酪、氯仿、異戊醇，各抽提一次； 將上清加入NaAc、冰冷無水己醇，輕輕混勻、離屯、，沉淀用70%己醇溶液洗漆，風干，加TE液溶解，低溫保存。
[0007] 在上述技術方案的基礎上，本發明還可W做如下改進 進一步，所述取材料，用液氮研成粉末，移入離屯、管，加入CTAB提取緩沖液，充分搖勻， 并進行水浴、離屯、步驟的具體實現如下： 稱取121.IgTris，溶于800ml水中，加入濃鹽酸并在不斷攬拌條件下，調節抑值至 8. 0,加入雙蒸水至總體積為比，分裝并高壓滅菌后4°C保存； 稱取186. 1班DTA-Na2? &0,加入900ml雙蒸水，磁力攬拌器上攬拌，加入化0H調節抑 值至8. 0,加雙蒸水定容至1L; 稱取4gCTAB，加100ml雙蒸水溶解，再加20ml/LTris-肥1 (p服.0)，8ml， 0. 5mol/L邸TA(P服.0)，56ml5mol/LNaCl，加雙蒸饋水至 200ml，室內保存； 取頭花寥幼嫩葉片，-7〇°C的低溫冰箱中保存備用，取冷凍頭花寥材料2g，立即放入冰 凍過的研鉢中，迅速在葉片上均勻撒上40-50mg的DIECA晶體，加入液氮后，快速研磨成粉 末狀； 將粉末快速移入1. 5ml離屯、管，加入600y1 65°C預熱的CTAB提取緩沖液，充分搖勻， 65°C水浴60min，期間混勻10-15次。
[0008] 進一步，所述取上清液，加入等體積的氯仿、異戊醇，取上清轉移至另一離屯、管 中，再次取上清液用氯仿、異戊醇抽提步驟的具體實現如下： 取上清液，加入等體積的氯仿：異戊醇，其中氯仿、異戊醇體積比為24:1，顛倒混勻 10-15次，取上清轉移至1. 5ml離屯、管中，再次取上清液用氯仿；異戊醇抽提1次，其中氯 仿、異戊醇體積比為24:1。
[0009] 進一步，所述將上清加入NaAc、異丙醇，輕輕顛倒混勻、離屯、5min，棄去上清液，用 70%己醇洗漆沉淀、離屯、，用小槍頭吸干己醇，風干步驟的具體實現如下： 稱取24. 608g無水醋酸鋼，加入雙蒸水70ml加熱至50-80°C溶解，再加入雙蒸水定容至 100ml，高壓滅菌20min，保存于4°C冰箱中備用； 將上清加入1/10體積3mol/LNaAc和2/3體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，12000巧m/min， 離屯、5min，棄去上清液，用70%己醇洗漆沉淀1次，12000巧m/min離屯、Imin,用小槍頭吸干 己醇，風干。
[0010] 進一步，所述去除沉淀中的己醇，用含RNA酶的TE溶解、消化至RNA完全裂解步驟 的具體實現如下； 去除沉淀中的己醇，用700y1含RNA酶（20yg/ml)的TE溶解，37°C消化化W裂解 RNAo
[0011] 進一步，所述分別用等體積的苯酪、氯仿、異戊醇，各抽提一次步驟的具體實現如 下： 分別用等體積的苯酪；氯仿；異戊醇，氯仿；異戊醇，在4°C，12000rpm/min，5min條件下 各抽提一次，其中苯酪、氯仿、異戊醇體積比為25 ;24 ;1，氯仿、異戊醇體積比為24 ;1。
[0012] 進一步，所述將上清加入NaAc、冰冷無水己醇，輕輕混勻、離屯、，沉淀用70%己醇溶 液洗漆，風干，加TE液溶解，低溫保存步驟的具體實現如下： 將上清加入1/10體積3mol/LNaAc和2倍體積的-20°C--70°C無水己醇，輕輕混勻； 在4°C，12000巧m/min，離屯、5min條件下，將沉淀用70%己醇溶液洗漆2次，風干，加 lOOylTE液溶解，低溫保存。
[0013] 本發明的有益效果是： 1. 改良CTAB法簡單、成本低廉、提取周期短； 2. 改良CTAB法可有效提取頭花寥DNA，A260/A280比值區間在1. 1-2. 0,比較傳統的SDS法、CTAB法具有更高的提取純度； 3. 測序結果表明，rbcL序列長度在979-985bp之間，rDNAITS序列長度為 661-666bp； 4. 序列比對和聚類分析結果表明，目的序列具有高度同源性； 5.測序結果提交NCBI獲得GenBank序列號。
【附圖說明】
[0014] 圖1本發明rbcL序列PCR擴增產物電泳圖譜； 圖2本發明ITS序列PCR擴增產物電泳圖譜。
[0015]
【具體實施方式】
[0016] W下結合實例對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并 非用于限定本發明的范圍。
[0017] 實施例； 分別取不同來源的頭花寥幼嫩葉片（見表1)，-70°C的低溫冰箱中保存備用，取冷凍頭 花寥材料2g，立即放入冰凍過的研鉢中，迅速在葉片上均勻撒上40-50mg的DIECA晶體， 加入液氮后，快速研磨成粉末狀；將粉末快速移入1. 5ml離屯、管，加入600y1 65°C預熱的 CTAB提取緩沖液，充分搖勻，65°C水浴60min，期間混勻10-15次。取上清液，加入等體 積的氯仿：異戊醇（24:1，V/V)，顛倒混勻10-15次，取上清轉移至另一 1.5ml離屯、管中，再 次取上清液用氯仿；異戊醇（24:1，V/V)抽提1次。稱取24. 608g無水醋酸鋼，加入雙蒸水 70ml加熱至50-80°C溶解，再加入雙蒸水定容至100ml，高壓滅菌20min，保存于4°C冰箱中 備用；將上清加入1/10體積3mol/LNaAc和2/3體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，12000巧m/ min,離屯、5min，棄去上清液，用70%己醇洗漆沉淀1次，12000巧m/min離屯、Imin,用小槍頭 吸干己醇，風干。去除沉淀中的己醇，用700y1含RNA酶（20yg/ml)的TE溶解，37°C消 化化W裂解RNA。分別用等體積的苯酪；氯仿；異戊醇（25 ;24 ;1，，V/V/V)，氯仿；異戊醇 (24 ;1,V/V)，在4°C，12000;rpm/min，5min條件下各抽提一次。將上清加入1/10體積3mol/ LNaAc和