一種高產n-乙酰神經氨酸代謝工程菌及構建方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種高產N-己酷神經氨酸代謝工程菌及構建方法和應用，屬生物工 程技術領域。
【背景技術】
[0002] N-己酷神經氨酸（Neu5Ac)是唾液酸的主要成分，其含量占整個唾液酸家族的 99%W上，通常Wa-糖巧的形式位于非還原性寡聚糖如糖蛋白和糖脂的末端。N-己酷神 經氨酸廣泛存在于各種生物體內，發揮著多種生理作用。在人體中主要能提高腸道對維生 素及礦物質的吸收、抗病毒和提高嬰幼兒神經系統的發育。
[000引 N-己酷神經氨酸W其所具有的的生理功能和特殊的結構，應用于食品、保健品和 醫藥中間體領域。食品和保健品領域主要應用于嬰幼兒奶粉的添加，W使嬰幼兒奶粉更接 近母乳的成分，促進嬰兒神經系統的發育。醫藥中間體領域主要用于抗流感藥物扎那米韋 合成的前體。
[0004] N-己酷神經氨酸的生產目前主要是通過WN-己酷氨基葡萄糖和丙酬酸鋼為底 物，W高表達神經氨酸醒縮酶和N-己酷氨基葡糖差向異構酶的基因工程菌催化，通過全細 胞或酶催化法而合成。該方法所需的底物N-己酷氨基葡萄糖成本較高，而且設及到雙酶高 表達的大腸桿菌發酵，步驟繁瑣，成本較高。發酵法生產唾液酸W其工藝簡單，綠色環保而 吸引了很多研究者的關注，也開發了不同的菌株用于N-己酷神經氨酸的合成。發酵法存在 的主要問題是目前的菌株N-己酷神經氨酸產量過低，導致其成本仍然過高，限制了其大規 模的應用。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是提供一種高產N-己酷神經氨酸代謝工程菌及構建方 法和應用。本發明通過用T7啟動子強表達N-己酷神經氨酸合成所需的neuBC基因，構建 新的高產N-己酷神經氨酸的基因工程大腸桿菌，提高了N-己酷氨基葡萄糖的產量。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明的高產N-己酷神經氨酸代謝工程菌，首先是選擇在 大腸桿菌中表達編碼UDP-N-己酷氨基葡萄糖差向異構酶編碼基因neuC和N-己酷神經氨 酸合成酶編碼基因neuB，實現利用葡萄糖合成N-己酷神經氨酸的目的。為了提高N-己酷 神經氨酸的產量，選擇了目前所知表達最強的T7啟動子作為上述兩個基因表達所需的啟 動子，詳見圖1，并敲除了N-己酷神經氨酸分解代謝基因簇nanATEK，阻斷N-己酷神經氨酸 的降解，達到在胞外積累終產物N-己酷神經氨酸的目的。
[0007] 所述UDP-N-己酷氨基葡萄糖差向異構酶基因neuC和N-己酷神經氨酸合成酶基 因neuB來源于空腸彎曲菌（Camp^obacterjejuni)或能表達相同功能酶的微生物，基因 的獲得可根據GenBankNo.AF400048中neuB和neuC基因序列全基因合成，或利用空腸彎 曲菌（如菌株ATCC43438)的基因組DNA為模板通過PCR擴增獲得，或采用過類似手段從其 他生物體獲得。
[000引所述分解N-己酷神經氨酸的nanAT邸基因簇為大腸桿菌自身基因組中所有，包含 了四個基因，分別為；N-己酷神經氨酸醒縮酶編碼基因nanA、N-己酷神經氨酸轉運蛋白編 碼基因nanT、N-己酷-6-磯酸甘露糖胺異構酶編碼基因na址和N-己酷甘露糖胺激酶編碼 基因nanK，四個基因連在一起，構成一個基因簇nanATEK。
[0009] 上述高產N-己酷氨基葡萄糖代謝工程菌的構建方法，具體步驟包括；敲除大腸桿 菌化21 0E3)中的分解N-己酷神經氨酸的nanAT邸基因簇，將neuBC基因克隆到表達載體 祀T24a上，轉入敲除了nanAT邸基因簇大腸桿菌化21 0E3)中，獲得高產N-己酷神經氨酸 代謝工程菌。其中，該構建方法，更加具體的步驟包括：
[0010] 1)敲除大腸桿菌化21觸扣中的基因簇nanATEK，獲得基因簇nanATEK失活的菌 株化21值E3)/AnanATEK;
[OCm] 2)克隆編碼UDP-N-己酷氨基葡萄糖差向異構酶和N-己酷神經氨酸合成酶的基因 neuBC至表達載體祀T24a，W實現該基因的超高表達；
[001引如將。中獲得的表達載體轉化入1)所得的菌株中，獲得高產N-己酷神經氨酸代 謝工程菌。
[0013] 所述高產N-己酷神經氨酸代謝工程菌于2015年4月28日保藏于中國典型培養 物保藏中屯、，地址在中國武漢大學，保藏號為CCTCCN0:M2015261，CCTCCN0:M2015261的分 類號為：大腸桿菌CAS0V-祀scherichiacoliCAS0V-CAS0V-5。
[0014] 本發明還公開了一種高產N-己酷神經氨酸代謝工程菌的應用，即利用上述工程 菌進行N-己酷神經氨酸的生產，該生產方法包括步驟：
[0015] 1)在S角搖瓶的培養基中活化培養高產N-己酷神經氨酸代謝工程菌種子；
[0016]。將培養好的高產N-己酷神經氨酸代謝工程菌種子逐級放大，并在相應含有發 酵培養基的發酵罐中進行好氣培養；
[0017]如培養至菌體濃度ODe。。為20~25時，加入異丙基-0 -D-硫代化喃半乳糖巧，誘 導相關蛋白的表達；
[0018] 4)至產物濃度不再增加，結束發酵工作。
[0019] 所述步驟1)和2)中的種子培養基和發酵培養基的配方如下：
[0020] 氮源，0.l-lOg/l，磯源 0.l-25g/L，葡萄糖或甘油 1-lOOg/L，微量元素 0. 01-50mg/ L。氮源包括酵母提取物、蛋白腺、玉米漿、錠鹽、硝酸鹽或其組合的混合物。磯源包括磯酸 及其鹽類。微量元素包括：鋪、鋒、鋼、棚、鉆、銅、鑲。
[0021] 5)使用該方法發酵該高產N-己酷神經氨酸代謝工程菌可得發酵液中N-己酷神經 氨酸產量在70g/LW上。
[002引本發明通過在大腸桿菌中超強表達N-己酷神經氨酸合成所需的酶，W提高N-己 酷神經氨酸的合成效率，同時，失活導致N-己酷神經氨酸消耗和回流的基因，阻止N-己酷 神經氨酸的回流和消耗，使得工程菌株能積累高濃度的N-己酷神經氨酸。通過本發明的方 法，得到一株基因工程大腸桿菌，該菌株可W利用葡萄糖或甘油合成高水平N-己酷神經氨 酸，同時，副產物的積累少，具有工業化生產的潛力。
【附圖說明】
[0023] 下面結合附圖與【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明：
[0024] 圖1是大腸桿菌中構建高水平N-己酷神經氨酸生產工程菌株代謝相關途徑。
【具體實施方式】
[0025] W下實施例中使用的質粒、PCR試劑等采用商業產品，具體操作按照說明書進行。 其他未注明的實驗操作按照常規分子操作方法進行。
[0026] 實施例1;高產N-己酷神經氨酸基因工程菌的構建
[0027] 一、采用Red重組方法，敲除菌株中的nanATEK基因簇，其具體步驟如下；
[002引 1、nanAT邸基因簇的敲除
[0029] 1)根據大腸桿菌化21觸：3)基因組佑enbankNo.CP001509)序列，設計引物；上 游引物F-nanA;
[0030] GCAACGAATTTACGTGGCGTAATGGCTGCACTCCTGACTATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO. 1所示）和下游引物R-nanK;
[003UTTTTTCTCCCTGGGCCAACAGCGCAGCCCCAAGTAAACCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQID NO. 2所示），利用引物F-nanA和R-nanK，W質粒地D13為模板，利用商業化的PCR試劑，經PCR擴增得到DNA片段，純化備用。
[0032] 2)LB培養基37度過夜培養大腸桿菌化21 0E3)，用氯化巧法制備感受態細胞，轉 化地D46,涂布氨節青霉素抗性LB平板，30度過夜培養，得到化21 0E3) /p邸46。
[003引 ^LB培養基中加入1% (m/V，質量體積百分比）的k阿拉伯糖，30°C震蕩培養菌 株化21 0)E3)/p邸46至0D600達到0. 8,然后制備感受態細胞。將上述制備好的DNA片段 電轉化入該感受態細胞內，涂布卡那霉素抗性（50yg/mL)LB平板，37度過夜培養得到轉化 子，W便同時消除質粒地D46。
[0034] 4)挑取轉化子，用菌落PCR鑒定
[0035]菌