一株高效抑制鐮刀菌和炭疽菌的生防菌Kg2A及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥領(lǐng)域，具體設(shè)及一株解淀粉芽抱桿菌Kg2A及其在防治胡 椒枯萎病和炭痘病的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胡椒是我國主要熱帶農(nóng)產(chǎn)品，是海南廣大農(nóng)民創(chuàng)收的重要農(nóng)作物，也是海南省經(jīng) 濟(jì)發(fā)展的一大支柱，它在國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展過程中有著愈來愈重要的作用。該是因?yàn)椋环?面，它的種子含有揮發(fā)油、胡椒堿、粗脂肪、粗蛋白等，是人們喜愛的調(diào)味品；另一方面，醫(yī)學(xué) 上胡椒可作為健胃劑、調(diào)熱劑、利尿劑及支氣管粘膜刺激劑，有散寒、健胃、溫中之功效，可 治療消化不良、積食不消、胃寒疼痛、屯、腹冷痛、寒濕反胃、大腸寒滑、虛脹冷積、支氣管炎、 冷頻、梅毒、感冒、風(fēng)濕骨痛和肺塞咳嗽疲多等多種疾??；此外，胡椒產(chǎn)業(yè)已成為海南島農(nóng)業(yè) 經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱和農(nóng)民脫貧致富的主要經(jīng)濟(jì)來源。另一方面，在生產(chǎn)上，胡椒是一種 重要的熱帶香辛植物，原產(chǎn)于印度西高止山脈的熱帶雨林中，目前我國海南、廣東、廣西、云 南、福建等?。▍^(qū)）均有種植。海南島作為我國主要胡椒生產(chǎn)區(qū)W及胡椒育種重點(diǎn)區(qū)域，植 椒面積約占中國植椒總面積的90%W上，適宜種植胡椒的地域是有限的，海南省種植胡椒 的氣候和立地條件得天獨(dú)厚，胡椒產(chǎn)品的質(zhì)地較越南等周邊傳統(tǒng)生產(chǎn)國家好。然而，海南胡 椒一般每畝每年可產(chǎn)干胡椒200 - 300市斤，管理良好的胡椒園每畝年產(chǎn)500 - 600市斤， 小面積高產(chǎn)的畝產(chǎn)一年可達(dá)1200市斤，總體來說單位面積平均產(chǎn)量不高，究其原因恐怕是 多方面的，但是有一點(diǎn)不可否認(rèn)的是由胡椒病害所帶來的嚴(yán)重影響。長期W來，海南島胡椒 品種單一化，W及長期連作均有利于各種病原菌的反復(fù)侵染，特別是胡椒癌病等±傳病害 的發(fā)生給胡椒生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的危害。
[0003] 生防細(xì)菌在植物病害的防治中占有十分重要的地位，其主要優(yōu)勢有；（1)生防細(xì) 菌復(fù)雜多樣的生防機(jī)制使病原菌不易產(chǎn)生抗藥性。生防細(xì)菌的抑菌機(jī)理有多種，并且通常 是兩種W上的抑菌機(jī)制協(xié)同作用起到防治病害的效果。在植物病害防治實(shí)踐中，普遍采用 的方法是同時(shí)使用活菌體和其括抗性代謝產(chǎn)物，該有利于各種抑菌機(jī)制互促互補(bǔ)，從而使 生防細(xì)菌的生防潛力得到最大限度的發(fā)揮。此外，細(xì)菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)（如細(xì)菌素） 能同時(shí)影響敏感菌的多種代謝途徑，如此W來，因病原菌發(fā)生突變而對細(xì)菌素產(chǎn)生抗性的 可能性就不像抗生素那樣容易。（2)生防細(xì)菌的活體應(yīng)用使得其防效較之其它微生物更為 持久是因?yàn)樯兰?xì)菌大多由農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中分離出來，一般情況下具有與病原菌相同或相 近的生態(tài)適應(yīng)及對寄主植物的親和性，定殖相對容易，再加上其繁殖迅速，使應(yīng)用細(xì)菌活體 防治病害成為可能。而用于生防的其他微生物類群，多數(shù)是利用它們的代謝產(chǎn)物防治病害。 相比之下，生防細(xì)菌定殖后能大量繁殖并建立產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的"活工廠"防效會更持久。（3) 代謝旺盛、產(chǎn)生括抗物質(zhì)周期短，與生防真菌或放線菌相比生防細(xì)菌繁殖速度快得驚人，在 適宜的條件下，幾十分鐘就分裂繁殖一次，一天W后便產(chǎn)生數(shù)千萬個(gè)后代。液體培養(yǎng)條件 下，44小時(shí)即可達(dá)產(chǎn)括抗物質(zhì)的高峰期。該有利于節(jié)約時(shí)間，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本。
[4] 有利于維持有益微生物的生態(tài)平衡，由于生防細(xì)菌所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)通常直接針對相 應(yīng)的病原菌起作用，特異性強(qiáng)，故此不會對農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)其它有益微生物產(chǎn)生不利影響，有 助于維持有益微生物的生態(tài)平衡。
[0004] 從胡椒上分離篩選獲得對胡椒病害枯萎病和炭痘病具有括抗作用的生防菌株，對 胡椒病害的防治具有重要的意義，但目前相關(guān)技術(shù)仍然很薄弱，至今有效防治胡椒病害的 括抗細(xì)菌未見正式報(bào)道，也沒有防治胡椒病害的生物農(nóng)藥的報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的針對現(xiàn)有技術(shù)的空白提供一株生防菌Kg2A及其在防治胡椒枯萎中 的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予W實(shí)現(xiàn)。
[0007]本發(fā)明采用的細(xì)菌是解淀粉芽抱桿菌炬acillus amyloliquefaciens)，保藏號為 CGMCC.No.10918。地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。
[0008] 本發(fā)明的生產(chǎn)菌株Kg2A分離自海南省大坡鎮(zhèn)的胡椒葉片，經(jīng)菌落和形態(tài)的顯微 觀察、染色反應(yīng)、常規(guī)生理生化特性試驗(yàn)W及16s rDNA序列分析，該菌株鑒定為解淀粉芽抱 桿菌炬acillus amyloliquefaciens)的一個(gè)新菌株，具有W下特征；（1)菌株呈直桿狀，常 W成對或鏈狀排列，具圓端或方端；芽抱楠圓、卵圓、柱狀、圓形，無英膜；革蘭氏染色陽性； (2)通過嘲噪實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、氧化酶、巧樣酸鹽生長實(shí)驗(yàn)等生理生化指標(biāo)，并結(jié)合《伯杰 細(xì)菌鑒定手冊》，鑒定結(jié)果Kg2A屬于枯草芽抱桿菌屬，結(jié)果與分子鑒定一致。
[0009] 生防菌Kg2A的基本培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基或YEP培養(yǎng)基。
[0010] 生防菌Kg2A的可利用碳源有；山梨醇、鼠李糖、維生素C、蘇氨酸、半乳糖、脯氨酸、 甘露醇、麥芽糖、脫氨酸、可溶性淀粉、葡萄糖、酪氨酸、果糖。
[0011] 生防菌Kg2A對環(huán)境的適應(yīng)能力比較強(qiáng)，可W在4°c-90°c的溫度范圍內(nèi)生長，在鹽 濃度為0-10%均能生長。
[0012] 本發(fā)明還研究了生防菌Kg2A對不同抗生素的敏感性，為化學(xué)防治打下基礎(chǔ)。
[0013] 本發(fā)明的菌株Kg2A對鑲刀菌、鑲抱炭痘菌和膠抱炭痘菌具有抑制作用。
[0014] 本發(fā)明的菌株Kg2A或其發(fā)酵液可W作為生物防治制劑使用，用于防治植物真菌 病害。
[0015] 本發(fā)明還提供一種解淀粉芽抱桿菌炬acillus amyloliquefaciens) Kg2A的應(yīng)用， 該菌株可W用于防治橡膠樹炭痘病、甘庶赤腐病和胡椒枯萎病。
[0016] 本發(fā)明還提供一種植物真菌病害的生物防治方法，向具有真菌病害的植物施用菌 株Kg2A或其發(fā)酵液，也可化施用含有上述菌株或其發(fā)酵液的生物防治制劑，也可W與其他 生物防治制劑聯(lián)合施用。
[0017] 本發(fā)明的菌株Kg2A具有廣譜抗菌性，培養(yǎng)簡單，適應(yīng)性強(qiáng)，抗菌能力穩(wěn)定，可W廣 泛應(yīng)用于多種植物真菌病害的防治。
【附圖說明】
[001引 圖1為Kg2A和其他生防菌的16SrDNAPCR產(chǎn)物電泳圖，泳道M為DNAmarker, 1 為Kgl，2 為Kg2, 3 為Kg2A，4 為Kg4。
[0019]圖2為生防菌Kg2A的革蘭氏染色結(jié)果。
[0020] 圖3為生防菌Kg2A對鑲抱炭痘菌的括抗效果圖。
[0021] 圖4為生防菌Kg2A對膠抱炭痘菌的括抗效果圖。
[0022] 圖5Kg2A對膠抱炭痘菌的括抗效果圖。
[002引圖6Kg2A對鑲刀菌的括抗效果圖。
【具體實(shí)施方式】[0024] 實(shí)施例1
[00巧]菌株Kg2A的分離培養(yǎng)和篩選純化 [002引 1.采樣
[0027] 樣品為海南省大坡鎮(zhèn)的胡椒葉片，將采集好的葉片放入塑料袋中并記錄。
[002引1. 2材料表面消毒與括抗細(xì)菌分離
[0029] 1. 2. 1清水沖洗與剪取病葉
[0030] 用清水洗去葉片上的灰塵砂堿，驚干。用剪刀在病健交界處剪取大小為5X5mm的 小葉片備用。
[0031] 1.2. 2樣品消毒
[0032] 將剪取的小病葉放入燒杯，用升隸浸泡30秒，在浸泡的過程中應(yīng)注意不斷輕輕攬 動小病葉，然后用無菌水沖洗S次，驚干，備用。
[0033] 1. 2. 3細(xì)菌分離培養(yǎng)
[0034] 用滅過菌的綴子將剪取的小葉片貼放到PDA固體培養(yǎng)基上，每皿均勻擺放4塊，再 將培養(yǎng)皿用保鮮膜密封。倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，28°C培養(yǎng)。每隔1化進(jìn)行觀察4她后將 長出的菌體轉(zhuǎn)接至相同的培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)4她后進(jìn)行純化；同時(shí)，將純化后所得的細(xì)菌 采用梯度稀釋涂布LB平板培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)4她后挑取單菌落接至相應(yīng)培養(yǎng)基斜面上。
[0035] 1. 3括抗細(xì)菌的篩選
[0036] 1.3. 1細(xì)菌的純化
[0037] 將放置于8~10°C培養(yǎng)箱中的斜面試管取出，在無菌操作臺中，將液體LB培養(yǎng)基 分裝到錐形瓶中，然后用接種針挑去少量的細(xì)菌于錐形瓶中，封口。28°C搖床上震蕩培養(yǎng)約 12小時(shí)，取出。然后用移液器吸取200yL于LB固體培養(yǎng)基上，涂抹椿涂抹均勻，于28°C培 養(yǎng)箱培養(yǎng)。然后再通過無限稀釋法處理獲得單一菌株。
[00測實(shí)施例2
[00測 菌株Kg2A的鑒定
[0040] 1、微生物學(xué)特性；
[0041] 對在37°C培養(yǎng)箱中劃線培育的生防菌株進(jìn)行形態(tài)特征觀察，發(fā)現(xiàn)生防菌株Kg2A 呈直桿狀，較少成鏈，具圓端或方端；芽抱楠圓、卵圓、柱狀、圓形，無英膜，為芽抱桿菌屬。經(jīng) 革蘭氏染色后菌體均呈現(xiàn)出藍(lán)紫色，為革蘭氏陽性菌。
[0042] 2、分子生物學(xué)鑒定：
[004引 （l)DNA提?。徊捎帽绢I(lǐng)域通用的試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取；
[0044] (2)PCR反應(yīng)；細(xì)菌通用引物8F和1492R，由英濰捷基（上海）貿(mào)易公司合成，結(jié)構(gòu) 如下；8F5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
[0045] 1492R5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，
[0046] 生防菌株Kg2A的16SrDNA基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增條帶長度約1500bp，與 預(yù)期大小一致；
[0047] (3)將PCR鑒定正確的重組菌送英濰捷基（上海）貿(mào)易公司基因測序。
[0048] 通過在NCBI網(wǎng)上進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示與枯草芽抱桿菌屬的同源性為99%，因 此推斷Kg2A菌株屬于枯草芽抱桿菌屬。
[0049] 3、生防菌的生理生化鑒定
[0050] (1)嘲噪試驗(yàn)
[0051] ①培養(yǎng)基配制：取1%膜蛋白腺水