一種螺旋藻類食品中微囊毒素的去除方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于食品檢測領域，具體涉及一種螺旋藻類食品中微囊毒素的去除方法。
【背景技術】
[0002]螺旋藻及小球藻是目前主要的食用藻類，因其含有豐富的維生素、礦物質及蛋白質等人體多種營養成分，其營養價值日益受到保健行業的關注與重視。研宄表明，螺旋藻可預防心腦血門疾病、調節血糖、防治便秘、提高人體免疫力、改善食欲，補充營養，防治發育不良、記憶下降、視力減退等，明顯改善體能和智力，因此，尤其適合學習、工作過于疲勞，精神壓力大、職業應激等主要原因容易造成亞健康狀態人群，而女性人群服用，更是可起到美容養顏，防治貧血的效果。藻類保健食品是一種主要由藻類單細胞植物粉為主要成分，加入少量賦形劑或單純用藻粉為原料制成的保健食品。目前，此類保健品日益受到國內外廣大消費者的青睞。世界衛生組織(WHO)定為“人類21世紀的最佳保健品”，1981年美國食品和藥品管理局(FDA)確認其為“最佳蛋白質來源之一”，我國衛生部也批準其為“新資源食品”。
[0003]而螺旋藻在人工養殖和自然環境中，都可能被有毒藍藻污染，伴生一類可對人類肝臟發生損害的微囊毒素。微囊毒素是一種單環7肽，至21世紀初已確定的MCYSTs的同分異構體已達60多種，是在藍藻水華污染中出現頻率最高、產毒量最大的一類藻類毒素。研宄表明，小鼠經腹腔注射LD 5Q約為25?150 μ g /kg,經口 LD 5(|是5000 μ g/ kg,它能通過胎盤屏障影響小鼠胎兒發育，造成胎鼠肝炎和腎受損，長期低劑量接觸微囊毒素可以引起它在人肝臟的蓄積，最終可以引起肝癌和其它肝臟疾病。因此，當人們長期大量食用含有微囊毒素的藻類保健品后，可對人體造成嚴重的傷害。因此，如何有效清除混在螺旋藻及其食品中的微囊毒素十分關鍵。近年來，國內外學者一直致力于螺旋藻中微囊毒素的清除，報道顯示，“食酸戴爾福特菌”、“蠟狀芽孢桿菌”等菌種也對水體中的微囊毒素有一定的去除作用，但目前，仍無完善的有關現有技術，而且單一的菌株對微囊毒素的降解效果十分有限。微生物協同作用是消除環境中有機污染物一種重要且有效的方法，微嗜酸寡養單胞菌可一定程度降解微囊毒素，本發明提供一種微囊毒素降解的輔助菌即藤黃微球菌，將其與微嗜酸寡養單胞菌一起用于微囊毒素的降解，不僅可有效降低螺旋藻及其食品中的微囊毒素，且可保持降解菌的穩定性，應用價值廣闊。
[0004]
【發明內容】
[0005]本發明的目的是解決現有技術中存在的上述問題，提供一種螺旋藻類食品中微囊毒素的有效去除方法。
[0006]本發明的技術方案如下:
一種螺旋藻類食品中微囊毒素的去除方法，包括以下步驟:
(I)樣品前處理:取螺旋藻固體樣品l-5g，置于碾缽中研碎后加提取溶劑，放入磁力攪拌器中攪碎，離心，沉淀后用GF/C濾紙過濾，再次加入提取液，并加入PH調節劑，調節PH至4-4.5，沸水浴，離心，并加入PH調節劑，調節PH至8-8.5，再次離心，以0.22um微孔濾膜過濾取濾液；
(2 )微囊毒素儲備液的制備:將步驟(I)中的濾液加入HLB柱中進行富集，洗脫，收集洗脫液置于燒瓶中，于旋轉蒸發儀上蒸干，再次富集，再次洗脫，并將洗脫液于旋轉蒸發儀上蒸干，取蒸干后的樣品加入3-5倍體積的甲醇，轉入離心管中，加5-10ml純化水溶解，離心，取上清液以0.22um微孔濾膜過濾除菌后，_20°C保存作為微囊毒素儲備液，并分別置于A、B及C三個培養皿中；
(3 )取藤黃微球菌與微嗜酸寡養單胞菌的混合菌接種于步驟(2 )中的A培養皿中，并取藤黃微球菌接種于B培養皿中，取微嗜酸寡養單胞菌接種于C培養皿中，均于28-30°C培養，取上清液經0.22um濾膜過濾后，進行微囊毒素含量的監測，每隔24h對三個培養皿各取一次樣，各取3次樣，以0.22um微孔濾膜過濾后，采用微囊毒素檢測試劑盒測定微囊毒素的含量。
[0007]優選的，步驟(I)中所述的螺旋藻固體樣品劑型選自膠囊、片劑或精粉中的一種或多種。
[0008]優選的，步驟(I)中所述的提取溶劑的加入量為30_50ml。
[0009]優選的，步驟(I)中所述的提取溶劑選自冰醋酸或醇溶液中的一種或多種。
[0010]優選的，步驟(I)中所述的冰醋酸為體積濃度為5-10%的冰醋酸。
[0011]優選的，步驟(I)中所述的醇溶液為丁醇、甲醇、水的混合溶液，優選的，所述的丁醇、甲醇和水的體積比為(1-3): (4-12): (20-50)ο
[0012]優選的，步驟(I)中與步驟(2)中所述的離心速度為10000-12000r/min，離心時間為20-30min ;步驟(I)中所述的沸水浴的時間為20_30min。
[0013]優選的，步驟(I)中所述的PH調節劑選自0.01-0.lmol/L的氫氧化鈉溶液、0.05-0.lmol/L的鹽酸溶液或0.03-0.08mol/L的氯化銨中的一種或多種。
[0014]優選的，步驟(2)中所述的洗脫過程具體為:先用20-30%的甲醇水溶液洗脫，再用90-100%的甲醇水溶液洗脫；再次洗脫過程具體為:先用濃度為10-20%的甲醇水溶液洗脫，再用60-70%的甲醇水溶液洗脫。
[0015]優選的，步驟(3)中A培養皿中藤黃微球菌與微嗜酸寡養單胞菌的接種量分別為2-5%，B培養甲中藤黃微球菌接種量為2-5%，C培養皿中微嗜酸寡養單胞菌的接種量為2-5% ο
[0016]本發明與現有技術相比，有益效果體現在:
1.研宄顯示，菌株之間的關系和協同機制不僅有利于豐富協同代謝理論，而且對于微生物降解污染物的實際應用具有指導作用。本發明，分別將微嗜酸寡養單胞菌及藤黃微球菌接種于三個含有微囊毒素的培養皿中，并連續監測三天微囊毒素的含量，以對三個培養皿中微囊毒素的含量進行動態觀察，而有在接種菌株時，接種量及培養環境均保證了統一性，使得培養及檢測的結果更可靠，也更具有說服力。
[0017]2.本發明在觀察微嗜酸寡養單胞菌及藤黃微球菌對微囊毒素的降解作用前，對螺旋藻樣品進行了精細的預處理，先進行微囊毒素的提取，常規的提取液(甲醇、酸化甲醇、EDTA.似2_酸化甲醇)雖然提取目標成分效果也好，但由于其組分太復雜，易產生基質效應，影響目標成分的提取。本發明中，采用冰醋酸或特定體積比的丁醇、甲醇的水溶液作為提取液，在提取兩種微囊毒素時可以得到較高的回收率，可有效提高目標組分的提取。再通過多次洗脫及富集制備微囊毒素的儲備液，保證了后續的微囊毒素的降解及含量測定準確、順利的進行。
【具體實施方式】
[0018]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明:
本發明中所述的檢測試劑盒為美國Beacon公司生產的微囊毒素檢測試劑盒，檢測限為0.l-02ug/L,檢測方法為ELISA方法。
[0019]實施例1
一種螺旋藻類食品中微囊毒素的去除方法，包括以下步驟:
(I)樣品前處理:取螺旋藻膠囊lg，置于碾缽中研碎后加30ml 5%的冰醋酸，放入磁力攪拌器中攪碎，以10000r/min離心20min，沉淀后用GF/C濾紙過濾，再次加入提取液，并加入0.05mol/L的鹽酸溶液調節PH至4，沸水浴20min，并加入0.01mol/L的氫氧化鈉溶液調節PH至8，再次以10000r/min離心20min，以0.22um微孔濾膜過濾取濾液；
(2 )微囊毒素儲備液的制備:將步驟(I)中的濾液加入HLB柱中進行富集，洗脫，收集洗脫液置于燒瓶中，于旋轉蒸發儀上蒸干，再次富集，再次洗脫，并將洗脫液于旋轉蒸發儀上蒸干，取蒸干后的樣品加入3倍體積的甲醇，轉入離心管中，加5ml純化水溶解，離心，取上清液以0.22um微孔濾膜過濾除菌后，_20°C保存作為微囊毒素儲備液，并分別置于A、B及C三個培養皿中；
(3)取藤黃微球菌與微嗜酸寡養單胞菌的混合菌接種于步驟(2)中的A培養皿中，并取藤黃微球菌接種于B培養皿中，取微嗜酸寡養單胞菌接種于C培養皿中，均于28°C培養，取上清液經0.22um濾膜過濾后，進行微囊毒素含量的監測，每隔24h對三個培養皿各取一次樣，各取3次樣，以0.22um微孔濾膜過濾后，采用微囊毒素檢測試劑盒測定微囊毒素的含量。
[0020]步驟(2)中所述的洗脫過程具體為:先用20%的甲醇水溶液洗脫，再用90%的甲醇水溶液洗脫；再次洗脫過程具體為:先用濃度為10%的甲醇水溶液洗脫，再用60%的甲醇水溶液洗脫。
[0021]優選的，步驟(3)中A培養皿中藤黃微球菌與微嗜酸寡養單胞菌的接種量分別為2%，B培養甲中藤黃微球菌接種量為2%，C培養皿中微嗜酸寡養單胞菌的接種量為2%。
[0022]結果顯示，三組培養皿中在接種藤黃微球菌與微嗜酸寡養單胞菌前，微囊毒素含量為16mg/L，在接種3d后，A培養皿中第3d時微囊毒素已全部降解，C培養皿中微囊毒素含量為3.85 mg/L，而B培養皿中3d時微囊毒素幾乎無降解