一種利用響應曲面法優化白刺多糖的復合酶微波提取方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，尤其設及一種利用響應曲面法優化白刺多糖的復合酶 微波提取方法。
【背景技術】
[0002] 裝襲科白刺屬（化'fraria)植物是一個古老的小屬，旱生或超旱生灌木、小灌木，全 世界已發現12種，我國有8種，主要分布在青海、新疆、甘肅、寧夏、內蒙古等地，資源十分豐 富。其中唐古拉特白刺（化卵toruffl)和西伯利亞白刺（化是西部蒙、藏、維 等少數民族的傳統藥材，用于多種疾病的治療，經常在中、藏藥復方中出現。現代藥理學研 究表明，白刺果實提取物具有降血脂、抗氧化、降血糖的作用，其所含黃酬類、生物堿類、月旨 肪酸類化合物是其重要活性成分。近年來，研究人員發現白刺果實中所含的維生素及礦質 元素對人體也具有明顯的保健作用。
[0003] 目前白刺果實化學成分和藥理作用的研究絕大多數集中在黃酬等小分子化合物， 對于多糖等活性生物大分子的研究較少。王凌云等（2006)對唐古特白刺果實多糖的提取 工藝進行了研究，通過正交實驗對傳統熱水回流提取法的參數進行了優化。結果表明，在料 液比為1:5,94°C下回流提取3次，每次化的條件下得到的白刺多糖含量為34. 562mg/g。 張玲等（2013)對白刺果實水溶性多糖的單糖組成進行了研究。白刺果實經石油離脫脂后， 采用80 °C熱水浸提法提取果粉中的水溶性糖，料液比1 ; 10 (g/mL)，提取2h，重復 提取3次，己醇沉淀，Sevage法除蛋白，反復醇洗脫色，經低溫干燥得到水溶性多糖(得 率約為1%)。單糖組成經測定，包括甘露糖、鼠李糖、半乳糖醒酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯 糖，其質量比約為 9.2 ; 3.3 ; 1.1 ; 1 ; 1.9 ; 2. 3。
[0004] 傳統提取方法效率低、操作復雜、周期長，且其中Sevag法脫蛋白處理所設及的氯 仿和正了醇，處理不當很容易造成有害溶劑殘留，產生健康安全隱患。此外，白刺多糖的生 物學活性不明確，導致其產品開發沒有方向，嚴重制約了白刺多糖的高值利用。因此，為了 合理和高效利用白刺資源，亟需提供一種操作簡單、提取率高、安全的從白刺果實中制備活 性多糖的方法。有關復合酶-微波輔助提取白刺抗衰老活性多糖的專利未見申請。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是提供一種操作簡單、提取率高的利用響應曲面法優 化白刺多糖的復合酶微波提取方法。
[0006] 為解決上述問題，本發明所述的一種利用響應曲面法優化白刺多糖的復合酶微波 提取方法，包括W下步驟： 山樣品制備： 將新鮮白刺果實洗凈，在30~35°C溫度下烘干48~7化后粉碎至40~80目，按10~30血/g料液比加入體積濃度為80%的己醇溶液，在18°C~25°C浸泡2~化后過濾，得到濾渣，該濾 渣于40~60°C下干燥12~2化，即得脫除脂類、色素和小分子糖的白刺果粉；然后在微波反應 器中，按10~18血/g不同的料液比加入復合酶溶液，40~50°C靜置浸泡1. 5~2.化的不同時 間，在330~370W的不同微波功率下按25~35min的不同時間進行反應提取，提取后的溶液 分別W4000~5000轉/min進行離心15~20min后收集上清液A，該上清液A經50~60°C真 空旋轉蒸發濃縮至原體積的1/6~1/8后，得到濃縮產物；所述濃縮產物中加入其體積3~4 倍的無水己醇溶液混勻，當其溶液中己醇濃度為80%時，于2~6°C下靜置12~2化，再分別W 4000~5000轉/min進行離屯、，15~20min后收集沉淀；沉淀加水復溶后，W4000~5000轉/min 進行離屯、，15~20min后收集上清液B，該上清液B于-70°C~ -85°C預凍4~6h，最后在大氣 壓力為10~100化、溫度為-55°C~ -70°C的條件下冷凍干燥24~72h，得到對應于不同微波功 率的白刺多糖提取物干燥粉末； 所述復合酶溶液是指蛋白酶、纖維素酶和果膠酶等質量混合后加去離子水配制而成的 抑為4~5的溶液； 口)用苯酪-硫酸法測定每個提取液中多糖含量： ① 標準曲線制作： 準確稱取10mg葡萄糖，配制成濃度為0. 1mg/mL的溶液，分別取0血、0. 1mL、0.2血、 0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0.6mL，依次補加蒸饋水至1mL;W蒸饋水作對照，分別向其中加 入0.5血6%的苯酪，振蕩搖勻，垂直快速加入2.5血濃H2SO4,振蕩搖勻后，靜止約30min, 冷卻至室溫，然后在490nm波長下測吸光值，W糖溶液濃度yg/mL為橫坐標，吸光值為縱 坐標，繪制標準曲線； ② 樣品中多糖含量的測定： 將樣品配置成60yg/mL的溶液，取樣品1mU不加蒸饋水，其余操作均與所述步驟① 制作標準曲線相同；在490nm波長下比色，所得數值在標準曲線上查出相應的總糖含量； 樹實驗設計與統計分析： ① 單因素試驗： 依次改變微波功率、提取時間、浸泡時間、料液比進行單因素試驗，用苯酪-硫酸法測 定所得的白刺多糖提取物中多糖的含量，并按下式計算多糖產率，每次處理重復=次： 多糖產率（％)=[(多糖含量X提取物重量）/果粉重量]X100%; ② 響應面法優化設計： 根據單因素試驗結果，選取多糖提取效果影響較顯著的微波功率、提取時間、浸泡時 間、料液比該4個因素，利用Desi即Expert8. 0軟件根據Box-Behnken設計原則進行實驗 設計，W微波功率Xi、提取時間X2、浸泡時間X3和料液比X4為自變量，W多糖的產率為響應 值y，建立多元二次回歸方程： y= -23. 15167 + 0. 12368Xi+ 0. 37283X2-0. 84933X3+0. 096067X4-6. 4X10-4x1X2+5.0X10-4X1X3+ 3.1X10-4X1X4-3.0X10-3X2X3+7.0X10-4X2X4-0.031X3X4- 1. 563Xl〇-4Xi2- 2. 42XlO^a'+O. 462X10-3X32- 5. 89X10-3X42; (4)實驗結果分析與優化： 利用DesignExpert8.0軟件根據多元二次回歸方程進行繪圖分析，得到回歸方程的 響應面及其等高線圖。
[0007]所述白刺為唐古特白刺（Nitrariataugutorum)或西伯利亞白刺（Nitraria sibirica)的成熟果實。
[000引本發明與現有技術相比具有w下優點： 1、本發明不僅利用復合酶酶解技術破壞植物細胞壁促進細胞內活性多糖成分的充分 溶出、水解果實中蛋白質成分提高多糖含量、避免氯仿等有害溶劑造成的安全隱患，而且利 用低功率微波穿透式內外加熱，在降低活性多糖結構破壞風險的同時促進多糖溶出、節省 提取時間。
[0009] 2、與正交法相比，本發明采用Box-Behnken Desi即S炬抓）中屯、組合設計模型的 響應面分析法，用4個變化因子、3個水平及少量的實驗組(僅29組實驗）就可W得出優化 結果，獲得最佳產率，在提高了提取效率的同時降低了能耗和污染物排放，具有工業化生產 的實際意義；并且所得的最佳提取條件不是設定的值，而是在設定條件的范圍之內。
[0010] 3、本發明獲得的白刺多糖最終產品為褐色粉末，易溶于水，經測試其糖含量為 58. 33%，糖醒酸含量為2. 62%，不含蛋白質，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醒酸、甘露糖和 半乳糖組成，不僅能夠有效阻止自由基的產生，而且能夠顯著清除已產生的自由基。
[0011] (1)糖醒酸含量檢測采用間哲基聯苯法，具體如下： ①標準曲線制備： 分別量取0. 1g/LD-GalA標準溶液0uL、50yL、100yL、200yL、300yL、400uL轉于玻璃試管（1.8X18cm)中，加蒸饋水補至400uL每個濃度重復S個樣品。向每支 試管中加入氨基橫酸試劑40UL，搖勻，再向各管加入濃硫酸2.5 111以振蕩均勻，沸水浴煮 沸20min。冷卻至室溫后，向各管中加入間哲基聯苯試劑40 搖勻，室溫放置15min。 在A525nm處測定吸光度A。W吸收度A為縱坐標，D-半乳糖醒含量（yg)為橫坐標，得 標準曲線。
[0012] ②樣品中糖醒酸含量測定： 取濃度0.1g/L左右的樣品溶液400uL按標準曲線制備方法之操作，測定吸收度，根 據標準曲線和樣品濃度計算其中的糖醒酸含量。重復3次，結果取平均數。
[0013] 口)蛋白質含量檢測采用考馬斯亮藍法，具體如下： ①考馬斯亮藍試劑的配置： 稱取10mg考馬斯亮藍G-250,溶解于5血的95%己醇中，加入10血的85%磯酸，用 蒸饋水定容至100 111以過濾備用。最終試劑中考馬斯亮藍的濃度為0.01% (w/v)，己醇濃度 為 4. 7% (w/v)。
[0014] ②標準曲線的制作： 分別取50yg/mL蛋白質標準溶液0血、0.2血、0.4血、0.6血、0.8血、1.0血，加蒸 饋水補至1.0mU分別向每支試管中加入考馬斯亮藍試劑4mU迅速振蕩混勻，靜置5min 后在595皿處測定光吸收值AweW吸收度Awe 縱坐標，牛血清白蛋白質量C(yg) 為橫坐標，制作標準曲線。
[0015] ⑨樣品中蛋白質含量的測定： 取0.1mg/血的樣品溶液1血，按W上操作，測定其595皿處測定光吸收值，根 據標準曲線計算樣品中的蛋白質含量。重復3次，結果取平均數。
[0016] 4、對本發明獲得的白刺多糖采用1-苯基-3-甲基-5-化挫咐酬（PMP)柱前 衍生化法進行