一種鉻-纖維蛋白原螯合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及檢測領域，更具體地說，設及一種銘-纖維蛋白原馨合物及其制備方 法和應用。
【背景技術】
[0002] 纖維蛋白原（fibrinogen,FG)其生理功能主要是作為凝血因子I而直接參與凝 血過程。在凝血共同途徑中，凝血酶先裂解纖維蛋白原兩條Aa鏈氨基端Argl6-Glyl7 釋放出一對纖維蛋白膚A，形成纖維蛋白單體I;在裂解纖維蛋白原兩條B0鏈氨基端 Argl4-Glyl5釋放出一對纖維蛋白膚B，形成纖維蛋白單體II，暴露纖維蛋白單體的聚合部 位，通過非共價結合，形成了不穩定的可溶性纖維蛋白單體。在活化的凝血因子XIII及Ca" 的作用下，纖維蛋白單體互相交聯，生成穩定的可溶性纖維蛋白，并將血液的有形成分包繞 其中，形成牢固的血栓。
[0003] 除參與凝血外，纖維蛋白原還具有其他多種功能，如與血小板膜糖蛋白IIb/IIIa 結合而介導血小板聚集反應，參與動脈粥樣硬化及腫瘤血行轉移等；纖維蛋白原水平還影 響血液粘度，尤其近年來人們發現血漿纖維蛋白原水平升高是屯、腦血管、血栓性疾病的重 要危險因素。血漿纖維蛋白原也是急性時相蛋白，在很多應激狀況下，如感染、嚴重外傷等 也可短時間內升高。
[0004] 銘（chromium,Cr)是元素周期表VI族中的一種過渡金屬，其質地堅硬，表面具有 光澤，有較高的烙點，在工業生產中具有重大的經濟價值，一個世紀W來被廣泛應用，每年 全球銘生產量高達107噸，因而銘是一種名副其實的重要金屬污染物。目前，銘廣泛應用于 電鍛、踩革、顏料、油漆、合金、印染等各個方面，與人們的生活息息相關，但是同樣也對人 類的身體健康產生巨大影響。在美國，化與化、(M、化被稱為四大環境污染物。據統計，每 年有幾十個億的民眾都在飲用銘污染的水源，而在加利福利亞有高達30%的水資源都已經 被銘污染，因而銘污染嚴重影響著人們的身體健康。
[0005] 自然界中銘主要價和六價的形式存在，而一般認為，S價銘（化3+)是人類所 需的微量元素，而六價銘（化6+)才是明顯的毒性物質。由于六價銘易通過細胞膜進入細胞， 而且可W通過一系列反應，產生強烈的細胞毒性及基因毒性，因而普遍認為六價銘的毒性 高于S價銘，達10-100倍。學者認為當水中的六價銘含量超過0.05mg/L即是有毒的。六 價銘可W通過皮膚接觸、食物攝入、飲用水飲入、呼吸道吸入等途徑進入人體，對于職業性 暴露人群主要是通過呼吸道吸入六價銘灰塵，而對于普通人群則是通過飲入污染水源、食 入被污染的食物、吸入等方式攝入六價銘。六價銘進入體內后，可W引發氧化應激、染色體 崎變、細胞調亡、多種DNA損傷（包括單鏈斷裂、DNA-蛋白質交聯、DNA-氨基酸交聯、化-DNA 配合物形成等），從而造成機體多處組織、器官、系統損傷。不僅如此，六價銘還被認為是一 種強有力的致癌物，早在1990年國際癌癥研究組織。
[0006] 銘與多種蛋白質之間關系密化可W與多種蛋白質結合，抑制多種蛋白酶的活性。 隨著對銘毒性研究的深入，人們逐漸認識到銘與蛋白的相互作用在其致毒過程中扮演著重 要的角色，被認為是了解銘的毒性機理的關鍵所在，因此，對銘和蛋白質相互作用的研究就 顯得愈發重要。而現在關于銘與蛋白質作用的機理僅是冰山一角，還有很多蛋白質與銘之 間的關系還不清楚，因而加強對于銘與蛋白質之間的關系至關重要。
【發明內容】
[0007] 針對銘污染嚴重的問題，本發明的目的在于提供一種銘-纖維蛋白原馨合物及其 制備方法，并建立銘-纖維蛋白原馨合物的定性、定量檢測方法，W便定量檢測銘-纖維蛋 白原馨合物在評價一個地區銘污染程度的應用。通過定量檢測一個地區人群血清中銘-纖 維蛋白原馨合物可W間接反映該個地區人群受銘污染的情況，從而間接反映該個地區銘污 染程度。
[000引本發明解決其技術問題所采用的技術方案是；提供一種銘-纖維蛋白原馨合物， 銘離子與纖維蛋白原通過琉基或/和半脫氨酸殘基馨合而成。
[0009] 本發明還提供一種上述的銘-纖維蛋白原馨合物的制備方法，包括W下步驟：
[0010] A)銘與纖維蛋白原的馨合反應：在提純源于人體的纖維蛋白原或按照生物學方 法重組的纖維蛋白原中加入銘離子進行馨合反應，得到反應溶液；
[0011] B)純化銘-纖維蛋白原馨合物的提取；采用免疫親和層析法，去除反應溶液中未 反應的纖維蛋白原W及多余的銘離子，即得銘-纖維蛋白原馨合物。
[0012] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下；
[001引 （1)溶解樣品；向經過步驟A)得到的反應溶液中加入生理鹽水使銘-纖維蛋白原 馨合物復溶；
[0014] 似平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與纖維 蛋白原特異性結合的填料，裝柱后，繼續使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0015] (3)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，纖維蛋 白原與填料特異性結合；
[0016] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液I;
[0017] (5)收集；收集洗脫液I;
[001引 （6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用d地20透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0019] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與銘特異性結合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0020] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[0021] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液II;
[0022] (10)收集；收集洗脫液II;
[002引 （11)透析；將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得銘-纖維蛋白原馨合物。
[0024] 其中，上述銘-纖維蛋白原馨合物的制備方法，還包括步驟C);對銘-纖維蛋白原 馨合物的鑒定；
[0025] 其中，步驟C)中具體如下：
[0026] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質制備膠床；
[0027] (2)加樣；取步驟B)中提取純化得到的銘-纖維蛋白原馨合物，加入稀釋緩沖液， 并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[00測 做電泳：連接電泳板，進行電泳；
[0029] (4)檢測；在膠床上找出含銘的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測是否含有銘W及檢測銘的含量。
[0030] 本發明還提供一種如上述的銘-纖維蛋白原馨合物在制備檢測人體內銘-纖維蛋 白原馨合物的試劑或試劑盒中的應用。
[0031] 本發明還提供一種至少包括如上述的銘-纖維蛋白原馨合物作為標準品的試劑 盒。
[0032] 優選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲纖維蛋白原的物質或捕獲 銘的物質。
[0033] 本發明還提供一種定量檢測銘-纖維蛋白原馨合物的方法，W已知含量的上述的 銘-纖維蛋白原馨合物作為標準品，采用W下方法之一對樣品進行檢測：酶聯免疫法、酶聯 免疫與原子吸收光譜結合法、酶聯免疫與電感禪合等離子體質譜結合法、提純銘-纖維蛋 白原馨合物與酶聯免疫結合法、提純銘-纖維蛋白原馨合物與原子吸收光譜結合法、提純 銘-纖維蛋白原馨合物與電感禪合等離子體質譜結合法、電泳與酶聯免疫或原子吸收光譜 或電感禪合等離子體質譜結合法。
[0034] 實施本發明的銘-纖維蛋白原馨合物及其制備方法和應用，具有W下有益效果：
[0035] 1.本發明首次體外合成銘-纖維蛋白原馨合物；
[0036] 2.本發明首次提出銘-纖維蛋白原馨合物可用于制備檢測血樣中銘-纖維蛋白原 馨合物的試劑或試劑盒中的應用。
[0037] 3.本發明建立了銘-纖維蛋白原馨合物的定性定量檢測方法，W便定量檢測 銘-纖維蛋白原馨合物在評價一個地區銘污染程度的應用。通過定量檢測一個地區人群血 清中銘-纖維蛋白原馨合物可W間接反映該個地區人群受銘污染的情況，從而間接反映該 個地區銘污染程度。本發明建立的銘-纖維蛋白原馨合物定量檢測方法其準確度大大提 高，并且使檢測的重復性得到大大提高。
【附圖說明】
[003引圖1為本發明所述的銘-纖維蛋白原馨合物的非變性電泳條帶圖；
[0039]圖2為本發明所述的銘-纖維蛋白原馨合物的電泳條帶的同步福射X線巧光分析 圖。
【具體實施方式】
[0040] 下面，結合【具體實施方式】，對本發明做進一步描述：
[0041] 本發明除特別說明外，設及的實驗操作步驟均為本領域常規的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發明中沒有列舉出來的均為本領域常用的試劑或可W通過市購方式 獲得：
[0042] 磯酸鹽溶液為0. 05-0.Imol/L化2冊〇4溶液或0. 5-lmol/L化2冊〇4溶液；
[0043] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0044] 膠床介質為瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種；
[0045] 捕獲纖維蛋白原的物質購買自Novus公司型號為A-0577的人纖維蛋白原抗體；其 中，本發明所述與纖維蛋白原特異性結合的物質、抗FG抗體、抗纖維蛋白原抗體均為捕獲 纖維蛋白原的物質；
[0046] 捕獲銘的物質購買自廣州然科生物科技有限公司的型號為服10641的抗銘抗體； 其中，本發明所述與銘特異性結合的物質、抗Cr抗體、抗銘抗體、銘抗均為捕獲銘的物質；
[0047] 酶標抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標記的抗體中的一種；
[0048] 底物為甲基聯苯胺（TMB)溶液；
[0049]洗漆液為含有KH2PO4O. 2mg/ml、化2冊〇4? 12&0 2. 90mg/ml、化C18.Omg/ml、KC1 0. 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的抑為 7. 4 的 0. 15MPBS溶液；
[0050] 封閉液為1% -5 %牛血