鴨疫里默氏桿菌OmpH重組蛋白及其ELISA試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程領域，特別設及一種鴨疫里默氏桿菌Om抑重組蛋白及其ELISA試劑盒。
【背景技術】
[0002] 鴨疫里默氏桿菌巧iemerellaanatipestifer,RA)是一種革蘭氏陰性菌，歸于黃 桿菌科（Flavobacteriaceae)，是鴨疫里默氏桿菌病的病原體，能夠引起鴨、鶴、火雞和多種 禽類的一種慢性或急性敗血癥狀的接觸性傳染疾病，呈世界性分布，發病率和死亡率高，已 成為目前嚴重危害養鴨業的主要傳染病之一。該病的臨床癥狀主要表現為精神沉郁，擁地、 縮頸、拉黃綠色稀便等癥狀；病變特征是引起宿主的纖維素性氣囊炎、腦膜炎、屯、包炎、肝周 炎、W及干酪性輸卵管炎，并伴有不同程度的敗血癥，對養殖業的發展存在著巨大的威脅。
[0003] 目前已建立的用于檢測鴨疫里默氏桿菌血清抗體的方法有瓊脂擴散試驗、凝集試 驗、全菌破碎作包被抗原的化ISA試驗、PCR檢測等。該些方法在檢測方面都存在諸多不足 之處。如瓊擴試驗和凝集試驗的靈敏度較低，特異性不高，只能檢測個別血清；PCR檢測雖 然靈敏但是在實際的生產當中運用難度大，需要專業的儀器和人員；破碎全菌的化ISA方 法雖然彰顯了在化ISA檢測方面的優勢，但是作為包被抗原，在制備菌體抗原時細菌培養 要求高且在菌體抗原成分復雜、特異性等方面存在不足。
[0004] OmpH屬于孔蛋白，目前未見鴨疫里默氏桿菌OmpH研究和應用的相關研究報道。
【發明內容】
[0005] 為克服現有技術中存在的缺點與不足，本發明的目的之一在于提供一種鴨疫里默 氏桿菌Om抑重組蛋白，該蛋白能作為鴨疫里默氏桿菌抗體的捕獲劑，為鴨疫里默氏桿菌的 抗體檢測提供了新思路。
[0006] 本發明的目的之二在于提供一種基于鴨疫里默氏桿菌Om抑重組蛋白的ELISA試 劑盒，可用于檢測鴨疫里默氏桿菌的血清抗體，有著較高的敏感性、特異性和重復性。
[0007] 本發明的目的之=在于提供一種鴨疫里默氏桿菌抗體的檢測方法，該方法操作簡 單，適用于大規模應用。
[000引本發明的目的通過下述技術方案實現；一種鴨疫里默氏桿菌OmpH重組蛋白，其氨 基酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0009] 上述的鴨疫里默氏桿菌Om抑重組蛋白的DM序列如SEQIDNO: 2所示。
[0010] 一種基于鴨疫里默氏桿菌OmpH重組蛋白的化ISA試劑盒，所述化ISA試劑盒包 括固相支持物、抗體捕獲劑、酶標二抗、底物、封閉液、終止液，所述抗體捕獲劑為如SEQID NO: 1所示的鴨疫里默氏桿菌Om抑重組蛋白。
[0011] 進一步，所述抗體捕獲劑為濃度> 8. 0yg/mL的鴨疫里默氏桿菌OmpH重組蛋白。
[0012] 進一步，所述酶標二抗為作400倍體積稀釋的羊抗鴨IgG-HRP。
[0013] 用所述的化ISA試劑盒檢測鴨疫里默氏桿菌抗體的方法，所述方法還包括平行的 陰性實驗，具體為：
[0014] A、將鴨疫里默氏桿菌Om抑重組蛋白與固相支持物連接，用封閉液封閉，洗漆去除 未結合的抗原及雜質，得固相抗原；
[0015]B、將待檢血清通過保溫反應使所述稀釋血清與步驟A所得固相抗原結合形成固 相抗原抗體復合物，洗漆去除固相載體上雜質；
[0016] C、將所述酶標二抗與所述固相抗原抗體復合物結合，得抗原一抗體一二抗復合 物；
[0017] D、在步驟C所得抗原一抗體一二抗復合物加入底物顯色液避光顯色后，加入終止 液終止反應得顯色樣品液；
[001引E、將步驟D所述顯色樣品液用酶標儀測0D450皿值，待檢血清的0D450皿值> 陰 性樣品0D450nm值的臨界值（即X+3SD)時判定為陽性，反之則為陰性，其中X為陰性樣品 0D450nm值的均值，SD為陰性樣品0D450nm值的標準方差。
[0019] 進一步，所述的化ISA試劑盒檢測鴨疫里默氏桿菌抗體的方法具體為：
[0020] 1)將濃度>8.0yg/血的鴨疫里默氏桿菌OmpH重組蛋白與固相支持物連接，用封 閉液封閉，洗漆去除未結合的抗原及雜質，得固相抗原；
[0021] 2)將待檢血清作100倍稀釋得稀釋血清，通過保溫反應使所述稀釋血清與步驟1) 所得固相抗原結合形成固相抗原抗體復合物，洗漆去除固相載體上雜質；
[0022] 3)將羊抗鴨IgG-HRP作400倍體積稀釋后的酶標二抗稀釋液與所述固相抗原抗體 復合物結合，得抗原一抗體一二抗復合物；
[0023] 4)在步驟3)所得抗原一抗體一二抗復合物加入底物顯色液避光顯色后，加入終 止液終止反應得顯色樣品液；
[0024] 5)將步驟4)所述顯色樣品液用酶標儀測0D450nm值，待檢血清的0D450nm值> 0. 37時則為陽性，反之則為陰性。
[0025] 進一步，步驟1)中所述鴨疫里默氏桿菌Om抑重組蛋白、步驟2)中所述稀釋血清 及步驟3)中所述酶標二抗稀釋液的加入量為等體積。
[0026] 本發明的有益效果在于：鴨疫里默氏桿菌Om抑重組蛋白是選取鴨疫里默氏桿菌 (RA)Om抑全基因編碼蛋白；然后利用基因工程技術，在對Om抑全基因克隆的基礎上，將其 與原核表達載體祀T-32a(+)連接，成功轉化大腸桿菌化2UDE3)表達系統進行誘導、表達 的基因工程產品。該蛋白的表達形式是OmpHAlis可溶性融合蛋白，表達的融合蛋白分子量 為38kDa，將產品設計為融合表達主要是考慮便于純化；同時表達蛋白為可溶性表達形式， 在蛋白的制備、純化過程中避免了蛋白的變性、復性等過程，利于保持蛋白的天然活性。經 原核表達系統表達后的產品經Westernblot進行鑒定后表明具有與天然蛋白相似的免疫 反應活性；本發明運用純化后的OmpHAlis融合蛋白作為包被抗原，建立了ELISA檢測試劑 盒，該方法可用于幾種不同血清型鴨疫里默氏桿菌血清抗體的檢測，具有重復性好、敏感度 高、特異性強等特點。
[0027] 采用本發明的方法生產的產品可用于：
[002引①本產品中OmpH重組蛋白可作為檢測鴨疫里默氏桿菌血清抗體的間接化ISA方 法等中的檢測抗原。
[0029] ②本產品中間接化ISA試劑盒可用于臨床鴨血清樣本中鴨疫里默氏桿菌抗體的 檢測。
[0030] 本發明的產品優點體現在：
[0031] ①由于該檢測抗原是鴨疫里默氏桿菌Om抑重組蛋白，并非全菌，因此應用該檢測 抗原進行檢測時無散毒危險。
[0032] ②本發明可W用于鴨疫里默氏桿菌RA-ATCC11845、RA-CH-1和RA-CH-2不同血清 型的抗體檢測。
[0033]⑨檢測鴨疫里默氏桿菌抗體，特異性強、重復性好、靈敏度高。
[0034] ④性能穩定、生產成本低，適合工廠化生產，市場應用前景廣。
【附圖說明】
[003引圖1為OmpH基因的PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中1為OmpH基因PCR擴增 產物經瓊脂糖凝膠電泳所獲得的特異性DNA條帶；M為DNAMarker。
[0036] 圖2為重組質粒pMD19-〇mpH的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，M為DMMarker; 1和2 為重組質粒pMD19-〇mpH用BamHI和化0I雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳所獲得的 兩條特異性條帶。
[0037] 圖3為祀T32a-〇mpH的酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，M為DNAMarker;1 和2為重組表達質粒祀T32a-〇mpH用BamHI和化0I雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳 所獲得的兩條特異性條帶。
[003引圖4為重組表達質粒祀T32a-0mpH表達的鴨疫里默氏桿菌OmpH重組蛋白在37°C、IPTG濃度為0. 4mmo1/L的條件下誘導表達過夜的SDS-PAGE電泳圖。其中M為蛋白質 Marker;1為重組表達質粒祀T32a-0mpH用IPTG誘導，得到的菌液超聲波破碎、離屯、后，所 得沉淀進行SDS-PAGE電泳的結果；2為重組表達質粒祀T32a-0mpH用IPTG誘導，得到的菌 液進行超聲波破碎、離屯、后，所得上清進行SDS-PAGE電泳的結果；3為空載體祀T-32a(+) 用IPTG誘導后經SDS-PAGE電泳所得結果。
[0039] 圖5為37°C時不同IPTG濃度下含有重組質粒祀T32a-〇mpH的宿主菌E.coli BL2UDE3)誘導表達4小時后鴨疫里默氏桿菌OmpH重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖。其中， M為蛋白質Marker;1為IPTG的終濃度為Ommol/L;2為IPTG的終濃度為0. 4mmol/L;3為 IPTG的終濃度為0. 8mmol/L;4為IPTG的終濃度為1. 2mmol/L。
[0040] 圖6為不同溫度下IPTG濃度為0. 4mmol/L時含有重組質粒祀T32a-〇mpH的宿主 菌E.coliBL21 〇)E3)誘導表達4小時后表達鴨疫里默氏桿菌OmpH重組蛋白的SDS-PAGE 電泳圖。其中，M為蛋白質Marker;1為誘導溫度為25°C;2為誘導溫度為30°C;3為誘導溫 度為37°C。
[0041] 圖7為37°C和IPTG濃度為0. 4mmol/L時不同誘導時間下含有重組質粒 pET32a-〇m抑的宿主菌E.coliBL21 〇)E3)表達鴨疫里默氏桿菌OmpH重組蛋白的SDS-PAGE 電泳圖。其中M為蛋白質Marker;1為誘導化；2為誘導化；3為誘導化；4為誘導化。
[0042] 圖8為鑲瓊脂糖凝膠（Ni2+-NAT)親和層析純化后的鴨疫里默氏桿菌Om抑重組蛋 白SDS-PAGE電泳圖。其中M為蛋白質Marker;1為經鑲瓊脂糖凝膠親和層析純化后的OmpH 重組蛋白；2為Img/mlBSA。
[004引圖9為鴨疫里默氏桿菌OmpH重組蛋白Western-blot圖。其中M為預染蛋白質 Marker;1為OmpH重組蛋白的免疫印跡條帶。
[0044] 圖10為鴨疫里默氏桿菌玻片凝集試驗結果圖。在1:2、1:4、1:8和陽性對照孔里 分別有細沙狀凝集顆粒；1:16孔內沒有凝集顆粒。
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