檢測pkd1基因突變的擴增引物、試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫學體外診斷技術，具體涉及常染色體顯性多囊腎病致病基因 PKDl 突變檢測的擴增引物組、試劑盒以及使用該引物組和試劑盒檢測檢測PKDl基因突變的方 法。
【背景技術】
[0002] 成人多囊腎病（polycystic kidney disease, PKD)是最常見的遺傳性腎病，人群 發病率約在1/400~1/1000,多為常染色體顯性遺傳，少部分為常染色體隱性遺傳。常染 色體顯性多囊腎病（autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)主要表 現為雙腎多發性進行性囊泡，引起腎臟結構和功能損害，是終末期腎病（end-stage renal disease, ESRD)最常見的遺傳病因，約占全部ESRD的10%，還可累及全身多個器官，如肝囊 月中、高血壓、顱內動脈瘤等。遺傳學研宄表明ADPKD主要由PKDl和PKD2基因突變引起，大 約80%~85%患者的致病基因為PKD1，導致I型多囊腎病，10%~15%患者的致病基因為 PKD2,導致II型多囊腎病。遺傳性多囊腎病是以雙腎形成多個進行性增大囊腫為主要特征 的單基因遺傳病，PKDl基因突變是造成成人多囊腎病的主要病因，且其患者較PKD2患者發 病早、臨床癥狀更嚴重。目前對ADPKD尚無特異的治療措施，只有一些對癥治療和延緩多囊 腎病向ESRD進展的干預措施。對患者進行基因檢測有助于明確診斷、直系親屬預后判斷， 并為再次生育產前檢測提供依據。PKDl位于人16ql3. 3,基因長52kb，含46個外顯子，編碼 區長度12906bp，在16號染色體上存在6個同源的假基因，與PKDl外顯子1至外顯子33序 列相比同源性高達97. 7%。PKDl基因結構復雜，突變種類多，可能涉及整個基因，沒有突變 熱點，且80%以上的致病突變都發生在基因的多拷貝區（外顯子1~33)，因此特異性檢測 PKDl基因突變較為困難。直到2001年，Rossetti等才聯合LR-PCR、巢式PCR及單鏈構象多 態性（single strand conformation polymorphism, SSCP)分析，第一次全面報道了高加索 人PKDl基因突變的情況。隨后有研宄者建立了基于變性高效液相色譜技術的突變篩查方 法，可以提高突變的檢出率，但兩種方法存在的影響因素較多，結果不夠穩定，準確性較低。 目前，對巢式PCR產物進行直接Sanger測序是常用的PKD基因診斷方法，雖然該方法更為 準確，但測序工作量巨大、效率低，且存在PCR脫靶現象，限制了該方法的大規模臨床應用。
[0003] 在現有技術中為了解決檢測PKDl基因突變效率低下的問題，研宄者們作了大量 的嘗試。蕭畔等（中國ADPKD患者PKDl基因突變位點檢測，《山東醫藥》，2007年，第47卷 第21期，1-2頁）僅對PKDl基因的12、14、21外顯子片段進行了擴增，該方法并不具備完全 檢測PKDl基因突變的效果。TW201339309A公開了一種檢測PKDl基因突變的引物組和試劑 盒，但其在擴增PKDl基因過程中所需要使用的引物組多達幾十組，雖然較為準確，但方法 過于繁瑣，反應體系需要后續純化，必須結合DHPLC進行后續處理，檢測成本過高、效率低。 張樹忠等（應用變性高效液相色譜技術檢測漢族人I型多囊腎致病基因突變，《中華醫學遺 傳學雜志》，2006年，第23卷第03期，283-288頁）采用的方法與TW201339309A類似，也有 類似的缺陷。
[0004] US7553644B2也公開了一種檢測PKDl基因突變的方法，但該方法中擴增PKDl基因 過程中所需要使用的引物組也過多，方法過于繁瑣，檢測效率低。CN104531883A公開了一種 檢測PKDl基因突變的試劑盒和檢測方法，涉及一種含有5對引物的引物組，該檢測方法中 測序采用的是第二代測序（next-generation sequencing, NGS)技術，該技術具有高通量、 快速、準確和成本低的優點，可實現多樣本、多個基因、多外顯子的同時檢測，但該方法采用 的NGS技術具有GC含量偏好性，尤其是不能得到PKDl外顯子1的有效數據。并且NGS技 術具有讀序短的特點，擴增的LR-PCR產物必須片段化得到短序列后方可進行建庫，為提高 通量每個樣本需要獨立建庫，大大提升了檢測成本。由于PKDl基因長度大以及方法自身的 限制，最后該方法只檢測到外顯子1之外的PKDl基因的外顯子和部分的內含子內含子，該 范圍并不能完全覆蓋已報道的致病位點；因此CN104531883A的檢測方法和引物序列組并 不能全面地反映出所檢測樣品中的所有PKDl基因突變，該方法所得到的假陽性檢測結果 和漏檢的可能較大。因此本領域仍然需要一種能高效、簡便、準確地檢測PKDl基因突變、并 且所需引物組較少的方法。
[0005] 第三代測序技術基于納米孔采用單分子讀取技術，有著更快的數據讀取速度和巨 大的應用潛能；在建庫階段不需要對DNA進行片段化處理，也不需要PCR擴增步驟，進一步 降低了測序成本。第三代測序技術以太平洋生物技術公司（Pacific Biosciences)PacBio RS II單分子實時（Single Molecular Real Time, SMRT)測序技術為代表，該單分子測序技 術是一種完全新型的測序技術，具有讀長超長、準確度高、GC偏向性小等特點，這一技術簡 稱PacBio SMRT測序技術，可以在一天之內完成從樣品制備到測序和讀取序列的全過程，非 常適合臨床快速診斷的要求。PacBio SMRT測序解決了第二代測序幾大困擾：變異檢測假陽 性高，稀有突變被淹沒，建庫階段無需擴增可直接對單個分子進行測序，有效避免了建庫擴 增偏好性和GC偏好性，可輕松跨越GC含量異常（過高或過低）及高度序列重復的區域，實 現序列覆蓋的完整性和均一性，長讀長（平均讀長達IOKbp-HKbp)特性可以直接對長片段 進行測序，無需打斷成小片段再進行測序。因此，PacBio SMRT測序技術可以對LR-PCR產 物進行直接測序，而不需要片段化處理和再次PCR擴增，而且采用引物標簽技術，不需要對 每個樣本單獨建庫，可以顯著提高檢測通量，降低單個樣品的檢測成本。目前還未有將將長 鏈PCR(Long-range PCR，LR-PCR)技術和PacBio SMRT測序技術結合，并將其應用于單基因 遺傳病基因診斷的研宄，更沒有將PacBioSMRT應用于常染色體顯性多囊腎病基因診斷領 域的研宄。
【發明內容】
[0006] 本發明涉及一種檢測PKDl基因突變方法，所述方法利用PKDl基因的序列信息設 計9對PCR標簽引物，應用長鏈PCR技術靶向擴增PKDl基因，同時在擴增產物加上標簽， PCR產物純化、混合后直接建單一 SMRTBell文庫，應用PacBio RS II測序儀進行測序，通過 生物信息學分析獲得PKDl基因突變信息。
[0007] 本發明提供了一種用于PCR特異性擴增檢測PKDl基因突變的引物組，該組PCR引 物共9對，所述一對PCR標簽引物由標簽和擴增待測目的序列的PCR引物組合而成，即在 每一對PCR標簽引物的5'端分別具有正向標簽和反向標簽。9對引物分別如下：用于擴增 PKDl基因外顯子1和內含子1的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 1所示，反向引物如SEQ ID NO: 2所示；用于擴增PKDl基因內含子1到外顯子8的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 3 所示，反向引物如SEQ ID NO:4所示；用于擴增PKDl基因外顯子7到外顯子13的引物，其 正向引物如SEQ ID NO: 5所示，反向引物如SEQ ID NO: 6所示；用于擴增PKDl基因內含子 12到外顯子15的引物，其正向引物如SEQ ID NO:7所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示； 用于擴增PKDl基因外顯子15到內含子21的引物，其正向引物如SEQ ID NO:9所示，反向 引物如SEQ ID NO: 10所示；用于擴增PKDl基因內含子21到內含子26的引物，其正向引物 如SEQ ID NO: 11所示，反向引物如SEQ ID NO: 12所示；用于擴增PKDl基因內含子26到內 含子34的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 13所示，反向引物如SEQ ID NO: 14所示；用于擴 增PKDl基因內含子34到內含子41的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 15所示，反向引物如 SEQ ID NO: 16所示；用于擴增PKDl基因內含子39到外顯子46的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 17所示，反向引物如SEQ ID NO: 18所示。優選的PCR引物如表1所示，擴增片段1 大小為2281bp，擴增片段2大小為4037bp，擴增片段3大小為3904bp，擴增片段4大小為 4398bp，擴增片段5大小為4358bp，擴增片段6大小為3202bp，擴增片段7大小為3910bp， 擴增片段8大小為2641bp，擴增片段9大