檢測肺癌kif5b-ret融合基因的引物、試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及一種檢測肺癌KIF5B-RET融合基因的引物、試劑 盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002] 肺癌是中國發病率和死亡率最高的癌癥之一，對人群健康和生命威脅很大。不少 肺癌患者存在癌基因的突變，這些驅動突變通過持續的激活信號蛋白，對肺癌的形成和維 持產生重要影響。這些代表性癌基因有EGFR、HER2、KRAS、ALK、BRAF、PIK3CA、AKTl、ROSl、 NRAS和MAP2K1等。上述很多基因的突變狀態與靶向藥物的敏感性相關，如EGFR基因的一 些突變對酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼和厄洛替尼敏感，而對ALK抑制劑克唑替尼耐受，但 存在ALK或ROSEl融合基因的患者則對克唑替尼治療敏感，而耐受吉非替尼和厄洛替尼。可 見相關癌基因的突變狀態對靶向藥物的選擇治療有著重要的指導作用。
[0003] 有接近一半的肺癌患者仍存在未知的臨床相關的癌基因突變，RET基因融合是較 新發現的一種肺癌驅動突變，與EGFR、KRAS等突變互斥，代表一種新的分子亞型，其突變人 群約占肺癌人群的1 %。KIF5B-RET融合導致RET的異常激活，從而激活下游細胞內信號通 路，導致細胞異常。故對RET融合基因（KIF5B-RET)的篩查，可對肺癌進行分子分型，并對 靶向藥物（凡德他尼）用藥作出指導。
[0004] 目前對融合基因的檢測方法較多，有熒光原位雜交（FISH)、PCR產物電泳、測序等 方法，但以上方法存在諸多弊端，如FISH檢測周期較長且所需探針等試劑昂貴；PCR產物電 泳經常會造成樣本污染問題，且對弱陽性樣本的評判存在人的主觀性；測序則對樣本質量 要求較高，檢測周期長，方法靈敏度較低。
【發明內容】
[0005] 為了解決上述技術問題，本發明的目的在于提供一種檢測肺癌KIF5B-RET融合基 因的引物，本發明還公開了包括有所述引物的試劑盒及其使用方法。
[0006] 本申請的發明人根據四種KIF5B-RET融合亞型，設計了四對特異引物，采用SYBR GREEN I染色real time-PCR的方法，可以快速、準確地定性檢測肺癌石蠟組織或新鮮組織 的KIF5B-RET融合基因。
[0007] 根據本發明的實施例，提供了一種用于檢測肺癌KIF5B-RET融合基因的引物，所 述引物包括5對引物，可同時擴增四種融合亞型和一個內參基因。
[0008] 所述KIF5B-RET融合的四種融合亞型為：K15 ;R12亞型、K16 ;R12亞型、K22 ;R12 亞型、K23 ;R12亞型。
[0009] 特異性擴增K15 ;R12亞型的引物序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示，
[0010] SEQ ID N0:1 5'-AGACCTTGCAGAAATAGGAATTG-3'
[0011] SEQ ID N0:2 5' -TCCAAATTCGCCTTCTCCTA-3'
[0012] 特異性擴增K16 ;R12亞型的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示，
[0013] SEQ ID NO:3 5' -GAGTTAGCAGCATGTCAGCTTC-3'
[0014] SEQ ID N0:4 5' -TCCAAATTCGCCTTCTCCTA-3'
[0015] 特異性擴增K22 ;R12亞型的引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，
[0016] SEQ ID N0:5 5' -CGCAAACTCTTTGTTCAGGA-3'
[0017] SEQ ID N0:6 5' -TCCAAATTCGCCTTCTCCTA-3'
[0018] 特異性擴增K23 ;R12亞型的引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，
[0019] SEQ ID N0:7 5' -ATCTCCTTTCTTGAAAATAATCTTG-3'
[0020] SEQ ID N0:8 5' -TCCAAATTCGCCTTCTCCTA-3'
[0021] 特異性擴增內參基因的引物序列如SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示，
[0022] SEQ ID N0:9 5' -CGCCCGCCGCGGCTTGTCCCGAGATGTTTAT-3'
[0023] SEQ ID N0:10 5' -CGCCCGCCGCCACAGCAGGACACCAAAAGA-3'。
[0024] 根據本發明的實施例，還提供了一種用于檢測肺癌KIF5B-RET融合基因的試劑 盒，其主要包括：分別裝有用于檢測肺癌KIF5B-RET融合基因四種融合亞型以及一種內參 基因的5對引物的試劑管，引物序列如SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO: 10所示；裝有熒光定量 taq酶的試劑管；裝有ROX染料試劑的試劑管；裝有去離子水的試劑管；分隔并集中包裝這 些試劑管的包裝盒。
[0025] 所述熒光定量taq酶為本領域常規的在實時熒光定量PCR中使用的熒光定量taq 酶試劑，優選的，所述焚光定量taq酶為寶生物公司的SYBR_? Premix Ex TaqTM II(2X) 試劑。
[0026] 所述ROX染料試劑為本領域常規的在實時熒光定量PCR中使用的ROX染料試劑， 優選的，所述ROX染料試劑為寶生物公司的ROX Reference Dye or Dye II (50X)試劑。
[0027] 本發明的引物和試劑盒的使用方法，包括以下步驟：
[0028] (1)使用常規方法提取待測樣本的RNA并進行反轉錄，得到cDNA ;
[0029] (2)以步驟⑴得到的cDNA為模板，進行熒光定量PCR擴增，在擴增時，以確定攜 帶相應KIF5B-RET融合基因亞型的樣本為陽性對照，以去離子水為陰性對照；
[0030] (3)分析得到的擴增曲線圖：若無擴增曲線升起，則為KIF5B-RET融合基因陰性； 若有擴增曲線跳起，則將其與陽性對照的峰值Tm值對比，若樣本與陽性對照的峰值Tm值相 同，則為KIF5B-RET融合基因陽性，若不同，則為KIF5B-RET融合基因陰性。
[0031] 通過以上技術方案，本發明的有益效果如下：
[0032] 本檢測方法針對最常見的四種KIF5B-RET融合亞型，設計四對特異引物及一對內 參引物，采用SYBR GREEN I染色real time-PCR的方法，來定性檢測肺癌石蠟組織或新鮮 組織KIF5B-RET融合基因，包括K15 ;R12、K16 ;R12、K22 ;R12、K23 ;R12四種融合亞型，這四 種融合亞型占到已報道融合病例的94. 4%。本發明的檢測具有成本低，檢測周期短，靈敏度 尚，不易污染等諸多優點。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合實施例對本發明的【具體實施方式】作進一步描述，本發明的優點和特點將 會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是示范性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。
[0034] 下述實施例中所使用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0035] 下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0036] 實施例檢測肺癌KIF5B-RET融合基因的試劑盒及其使用方法
[0037] 1.該用于檢測肺癌KIF5B-RET融合基因的試劑盒中裝有：
[0038] (1)引物
[0039] 特異性擴增K15 ;R12亞型的引物序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示，
[0040] SEQ ID N0:1 5'-AGACCTTGCAGAAATAGGAATTG-3'
[0041] SEQ ID N0:2 5' -TCCAAATTCGCCTTCTCCTA-3'
[0042] 特異性擴增K16 ;R12亞型的引物序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4所示，
[0043] SEQ ID N0