一種用于IgA腎病檢測(cè)的系統(tǒng)、方法及方法的建立的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)療診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種用于IgA腎病檢測(cè)的系統(tǒng)、方法 及方法的建立。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，IgA腎病診斷的主要的檢測(cè)方法是腎活檢，特征是腎小球系膜區(qū)IgA團(tuán)塊樣 或顆粒樣沉積，腎活檢時(shí)患者呈俯臥位，穿刺針在超聲的引導(dǎo)下于患者背部進(jìn)針，快速取出 腎組織，在一系列固定和染色后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察腎臟變化情況，以診斷 腎病類(lèi)型和判斷預(yù)后，但腎活檢存在著至少下列所述的技術(shù)缺點(diǎn)：
[0003] 1、腎活檢為創(chuàng)傷性檢查，在早期患者尿常規(guī)正常的情況下，不推薦進(jìn)行腎活檢。在 患者病情加重需要重新評(píng)估腎臟病理時(shí)，多次穿刺不僅加重腎損傷，還有合并出血、感染等 并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，難以反復(fù)進(jìn)行。
[0004] 2、腎活檢有許多禁忌癥。如絕對(duì)禁忌癥、出血傾向明顯、重度1?血壓、精神病或不 配合者、孤立腎、小腎等；相對(duì)禁忌癥，腎臟感染呈活動(dòng)期(如活動(dòng)性腎盂腎炎、腎結(jié)核、腎膿 腫)、腎腫瘤或腎動(dòng)脈瘤、多囊腎、過(guò)度肥胖、慢性腎功能衰竭、重度腹水、心功能衰竭、妊娠 等。因此，不是每個(gè)腎臟病患者都適合做腎活檢檢查。
[0005] 3、腎活檢還有許多的并發(fā)癥。最常見(jiàn)的如血尿，腎周?chē)撃[，腰痛及腰部不適，發(fā) 熱，動(dòng)靜脈瘺等。
[0006] 4、腎活檢從準(zhǔn)備穿刺到得到病理結(jié)果耗時(shí)較長(zhǎng)，準(zhǔn)備步驟較多，反應(yīng)較慢。由于 是有創(chuàng)檢查，患者需要術(shù)前停用抗凝藥，對(duì)于有心血管疾病必須長(zhǎng)期使用抗凝藥的患者不 利，且患者術(shù)后必須躺在床上24小時(shí)絕對(duì)臥床，不得下床走動(dòng)。而從穿刺出腎組織到固定、 石蠟包埋、免疫組化染色，直到最后顯微鏡下觀察得出病理結(jié)果，一般需要5-7天時(shí)間，對(duì) 于進(jìn)展較快的急進(jìn)性腎小球腎炎等腎病往往會(huì)造成診斷不及時(shí)，錯(cuò)診或漏診的情況時(shí)有發(fā) 生。
[0007] 因此，目前IgA腎病的診斷技術(shù)有待進(jìn)一步改進(jìn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的是建立一種用于IgA腎病檢測(cè)方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中的檢 測(cè)時(shí)對(duì)機(jī)體創(chuàng)傷大、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、適用范圍小、檢測(cè)步驟復(fù)雜的技術(shù)問(wèn)題。
[0009] 本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種用于IgA腎病檢測(cè)方法，旨在提供一種無(wú)機(jī)體 創(chuàng)傷、檢測(cè)時(shí)間短、適用范圍大、檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單的IgA腎病檢測(cè)方法。
[0010] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于IgA腎病檢測(cè)的系統(tǒng)，旨在提供一種適用于 無(wú)機(jī)體創(chuàng)傷、檢測(cè)時(shí)間短、適用范圍大、檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單的IgA腎病檢測(cè)方法的系統(tǒng)。
[0011] 本發(fā)明提出了一種用于IgA腎病檢測(cè)方法的建立，包括：
[0012] S10、采集IgA型腎病患者、非IgA型腎病的腎病患者以及健康者的尿液；
[0013] S20、檢測(cè)尿液中miRNA的表達(dá)量；
[0014] S30、利用相對(duì)定量法比較所述miRNA的表達(dá)量；
[0015] S40、對(duì)所述miRNA的表達(dá)量進(jìn)行ROC曲線分析。
[0016] 可選的，所述 miRNA 為 miRNA-25、miRNA-144 以及 miRNA-486 中的至少一種。
[0017] 可選的，檢測(cè)miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486的表達(dá)量是通過(guò)選自熒光定量 PCR、Taqman探針以及LightCycle探針中的至少一種方法進(jìn)行的。
[0018] 可選的，所述熒光定量PCR為SYBR Green熒光定量PCR。
[0019] 可選的，MiRNA-25 的引物為：CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA ;
[0020] 和 / 或，MiRNA-144 的引物為：UACAGUAUAGAUGAUGUACU ;
[0021] 和 / 或，MiRNA-486 的引物為：UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG。
[0022] 可選的，還包括管家基因的引物為：AAAGCAGGCUUUAAAGGAACCU。
[0023] 可選的，miRNA-25的臨界值為0. 058 ;
[0024] 和 / 或，miRNA-144 的臨界值為 0· 007 ;
[0025] 和 / 或，miRNA-486 的臨界值為 0· 025。
[0026] 本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提出一種用于IgA腎病檢測(cè)方法，所述方法是根據(jù)以上 所述的方法建立的方法，包括以下步驟：
[0027] 采集尿液；
[0028] 檢測(cè)尿液中miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486中至少一個(gè)的表達(dá)量；
[0029] 判斷miRNA-25、miRNA-144或miRNA-486的表達(dá)量是否高于其各自的所述臨界值。
[0030] 可選的，所述熒光定量PCR為SYBR Green熒光定量PCR。
[0031] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提出一種用于IgA腎病檢測(cè)的系統(tǒng)，所述用于IgA腎病檢 測(cè)的系統(tǒng)利用以上所述的用于IgA腎病檢測(cè)的方法進(jìn)行檢測(cè)，所述系統(tǒng)包括：
[0032] 尿液米集裝置，以米集尿液；
[0033] miRNA檢測(cè)裝置，以檢測(cè)尿液中miRNA的表達(dá)量。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的用于IgA腎病檢測(cè)方法的建立，可以取得以下所述的至少一種積極 技術(shù)效果：
[0035] 1、可以有效地建立一種用于IgA腎病檢測(cè)方法。
[0036] 2、由于檢測(cè)的樣本是尿液，而不是腎組織，所以本發(fā)明的最明顯的優(yōu)勢(shì)就是具有 無(wú)創(chuàng)傷的特點(diǎn)，可以根據(jù)疾病的病情變化需要反復(fù)或連續(xù)留取和測(cè)試。另外，所需留取尿液 不會(huì)給患者帶來(lái)任何損傷和風(fēng)險(xiǎn)，非常安全可靠。
[0037] 3、由于檢測(cè)時(shí)無(wú)明顯禁忌癥，可以適用于所有患者的檢測(cè)。
[0038] 4、由于所用的光定量PCR、Taqman探針以及LightCycle探針的方法已經(jīng)是常見(jiàn)的 技術(shù)手段，并且具有檢測(cè)準(zhǔn)確、安全可靠、簡(jiǎn)單易行等的優(yōu)點(diǎn)，一般的醫(yī)護(hù)人員，例如鄉(xiāng)鎮(zhèn)和 社區(qū)的基層醫(yī)護(hù)人員，經(jīng)1周左右的培訓(xùn)就可完全掌握該方法，大大縮短了培訓(xùn)周期，有效 解決了現(xiàn)有腎組織活檢對(duì)于醫(yī)院和醫(yī)護(hù)人員要求嚴(yán)格限制的問(wèn)題，從而使本發(fā)明具有更廣 闊的應(yīng)用空間和巨大的推廣價(jià)值。
[0039] 5、與現(xiàn)有腎組織活檢的3000元的費(fèi)用相比，本發(fā)明所用試劑盒一套僅需5700元 左右，可反復(fù)使用50次，從而大大降低了患者的診斷費(fèi)用。
[0040] 6、現(xiàn)有腎組織活檢從患者入院準(zhǔn)備到最后給出診斷報(bào)告周期大約為1周，而本發(fā) 明能在24小時(shí)內(nèi)給出結(jié)果，且不影響患者的工作、學(xué)習(xí)和生活，不僅大大縮短了患者等待 時(shí)間，也為患者爭(zhēng)取到了及時(shí)對(duì)癥治療的寶貴時(shí)間，可以有效防止錯(cuò)診或漏診情況的發(fā)生。
[0041] 7、由于患者的尿液簡(jiǎn)單易得，且容易保存，還適合偏遠(yuǎn)地區(qū)大量篩查患者時(shí)的使 用。
【附圖說(shuō)明】
[0042] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中：
[0043] 圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例中的用于IgA腎病檢測(cè)方法的建立的方法流程示意圖；
[0044] 圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例中的IgA腎病患者與健康者對(duì)照組間MiRNA-25表達(dá) 量的比較圖，在圖中，橫坐標(biāo)為分組，1為健康者對(duì)照組，2為IgA腎病患者組,縱坐標(biāo)為 MiRNA-25的相對(duì)表達(dá)量；
[0045] 圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例中的IgA腎病患者與健康者對(duì)照組間MiRNA-144表達(dá) 量的比較圖，在圖中，橫坐標(biāo)為分組，1為健康者對(duì)照組，2為IgA腎病患者組,縱坐標(biāo)為 MiRNA-144的相對(duì)表達(dá)量；
[0046] 圖4是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例中的IgA腎病患者與健康者對(duì)照組間MiRNA-486表達(dá) 量的比較圖，在圖中，橫坐標(biāo)為分組，1為健康者對(duì)照組，2為IgA腎病患者組,縱坐標(biāo)為 MiRNA-486的相對(duì)表達(dá)量；
[0047] 圖5是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例中的IgA腎病患者與非IgA型腎病的腎病患者對(duì)照組間 MiRNA-25表達(dá)量的比較圖，在圖中，橫坐標(biāo)為分組，1為IgA腎病患者組，2為非IgA型腎病 的腎病患者對(duì)照組，縱坐標(biāo)為MiRNA-25的相對(duì)表達(dá)量；
[0048] 圖6是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例中的IgA腎病患者與非IgA型腎病的腎病患者對(duì)照組間 MiRNA-144表達(dá)量的比較圖，在圖中，橫坐標(biāo)為分組，1為IgA腎病患者組，2為非IgA型腎病 的腎病患者對(duì)照組，縱坐標(biāo)為MiRNA-25的相對(duì)表達(dá)量；
[0049] 圖7是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例中的IgA腎病患者與非IgA型腎病的腎病患者對(duì)照組間 MiRNA-486表達(dá)量的比較圖，在圖中，橫坐標(biāo)為分組，1為IgA腎病患者組，2為非IgA型腎病 的腎病患者對(duì)照組，縱坐標(biāo)為MiRNA-25的相對(duì)表達(dá)量；
[0050] 圖8是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例中的miRNA表達(dá)量的ROC曲線分析圖，在圖中，橫坐標(biāo)為 特異性，縱坐標(biāo)為敏感性，1為MiRNA-25, 2為MiRNA-144, 3為MiRNA-486,4為標(biāo)準(zhǔn)參考曲 線.
[0051] 圖9是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例中的miRNA表達(dá)量的ROC曲線分析圖，在圖中，橫坐標(biāo)為 特異性，縱坐標(biāo)為敏感性，1為聯(lián)合上述3個(gè)MiRNA指標(biāo)，2為標(biāo)準(zhǔn)參考曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0052] 下文中將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。需要說(shuō)明的是，在不沖突的 情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合，另外，實(shí)施例是示例性的，僅 用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0053] 在本發(fā)明中，如無(wú)特殊說(shuō)明，所用專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)按照以下所述理解：
[0054] (1)腎活檢：通常情況下叫做腎穿刺，是指在超聲的引導(dǎo)下，穿刺針在患者背部穿 入腎臟，取出部分腎組織，在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察腎臟組織病變情況的手術(shù)。由 于腎臟疾病的種類(lèi)繁多，病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，許多腎臟疾病的臨床表現(xiàn)與腎臟的組織學(xué) 改變并不完全一致，為了明確疾病的病因病理，進(jìn)一步確診患者所患的具體病種，這時(shí)就需 要做腎穿刺活檢術(shù)。
[0055] (2) MicroRNA (miRNA):是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非 編碼RNA，其大小長(zhǎng)約20~25個(gè)核苷酸。成熟的miRNAs是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)一系 列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的 方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的 翻譯。
[0056] (3) SYBR Green熒光定量PCR :SYBR Green熒光定量PCR是一種結(jié)合于所有雙鏈 DNA (人及大多數(shù)生物細(xì)胞內(nèi)都是雙鏈DNA)雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波