一種基于微小RNA let-7a診斷子宮內(nèi)膜腺癌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于微小RNA let_7a診斷子宮內(nèi)膜腺癌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]子宮內(nèi)膜腺癌(endometrial carcinoma, EC)是常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，約占女性癌瘤的7%，占女性生殖道惡性腫瘤的20-30%。近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢，是威脅絕經(jīng)后婦女健康的主要腫瘤之一。目前研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜腺癌有兩種類型，一種為雌激素依賴型(I型子宮內(nèi)膜腺癌)，一種為非雌激素依賴型(II型子宮內(nèi)膜腺癌)，兩型的高危因素不同。前者的發(fā)生與雌激素長期刺激有關(guān)，多發(fā)生在內(nèi)膜增生的基礎(chǔ)上，病理類型以腺癌為主，分化好，肌層浸潤淺，預(yù)后較好。后者與雌激素的刺激關(guān)系不大，多發(fā)生在萎縮內(nèi)膜基礎(chǔ)上，病理類型以漿液性乳頭狀腺癌多見，分化差，容易有深肌層浸潤，預(yù)后不良。雖然I型子宮內(nèi)膜腺癌常見且研究較多，但雌激素增高造成子宮內(nèi)膜增生乃至癌變的具體機(jī)制仍然不明確。
[0003]人類疾病往往是由于一些基因表達(dá)紊亂或失控所引起的。小RNA(microRNA, miRNA)是一類小分子非編碼RNA，通過核酸序列互補(bǔ)性結(jié)合到特定的靶mRNA上來調(diào)節(jié)翻譯或降解靶mRNA，是一種起負(fù)調(diào)控作用的分子。人類基因組中已確認(rèn)的miRNA有幾百個，可能參與30%人類基因組遺傳信息的表達(dá)調(diào)控。miRNA作為新發(fā)現(xiàn)的參與高等生物基因表達(dá)調(diào)控的明星分子，在細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育生物學(xué)和一些疾病如癌癥、艾滋病等方面都起到重要作用。Calin等人研究發(fā)現(xiàn)患有一種成年型B細(xì)胞慢性淋巴型白血病(CLL)常有miR-15a和miR-16-l基因簇的缺失或是表達(dá)下調(diào)。但目前少有關(guān)于miRNA與子宮內(nèi)膜腺癌相關(guān)性的報道。研究miRNA基因的表達(dá)譜，尋找與子宮內(nèi)膜腺癌相關(guān)的miRNA基因，并對其功能進(jìn)行研究，有可能發(fā)現(xiàn)新的子宮內(nèi)膜腺癌易感基因和新的藥物靶點，有助于更好地理解子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)病機(jī)制。
[0004]let_7a是一類高度保守的miRNA分子，最初是在線蟲的研究中被發(fā)現(xiàn)。鑒于miRNA在生命體中的廣泛作用，我們認(rèn)為一些參與子宮內(nèi)膜腺癌重要生理或病理過程的關(guān)鍵基因會受到某些miRNA的調(diào)控。為了研究miRNA在子宮內(nèi)膜腺癌中的作用，我們利用基因芯片(microarrays)法研究了子宮內(nèi)膜腺癌病人組織中miRNA的表達(dá)譜變化?；蛐酒軌蜢`敏、快速對人類體內(nèi)成熟的miRNA的表達(dá)進(jìn)行大規(guī)模的檢測和定量。與傳統(tǒng)的Northern雜交，以及核糖核酸酶保護(hù)法(ribonuclease protect1n assays)相比,基因芯片法不需要接觸放射性同位素，且所需要的樣品量相對較少，檢測范圍廣。我們應(yīng)用這一分析手段研究了 2個子宮內(nèi)膜腺癌病人的腫瘤組織和周圍正常組織中的miRNA的表達(dá)譜特征。研究結(jié)果顯示，17個miRNAs在子宮內(nèi)膜腺癌病人中的表達(dá)水平明顯低于正常人，而另外15個miRNA表達(dá)顯著上調(diào)。值得注意的是，let-7a在內(nèi)膜腺癌腫瘤組織中的表達(dá)下調(diào)最為明顯，約4?5倍。相關(guān)的研究表明，let-7a屬于抑癌基因一族。在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87中過量表達(dá)let_7a，抑制細(xì)胞的體外增殖和轉(zhuǎn)移，和降低裸鼠體內(nèi)所成腫瘤的大小。另外，肝癌細(xì)胞的研究顯示，let-7a參與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，因此可以增強(qiáng)藥物sorafenib (誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡)的治療效果。此外，人為降低let_7a的表達(dá)顯著增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力，重要的是以let_7a喂食荷瘤小鼠，顯著抑制腫瘤的生長。結(jié)合其它研究報道，表明let_7a作為腫瘤抑制基因的功能和相關(guān)分子機(jī)制的研究已越來越受到關(guān)注，相關(guān)的研究結(jié)果也指出miRNA的替代療法有望成為新的腫瘤治療方法。盡管已取得的一些進(jìn)展，但是let_7a如何影響子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生發(fā)展至今未見相關(guān)報道。
[0005]子宮內(nèi)膜腺癌中差異表達(dá)的miRNAs可能通過影響其調(diào)節(jié)的靶基因的表達(dá)，從而參與疾病的發(fā)生發(fā)展。我們利用生物信息學(xué)分析這17個miRNAs潛在的調(diào)節(jié)靶基因。目前認(rèn)為miRNA發(fā)揮作用的基礎(chǔ)在于其與靶基因3’UTR的互補(bǔ)配對。良好的配對可導(dǎo)致靶mRNA的降解，部分配對則主要會抑制靶mRNA的翻譯。其中對配對作用最為關(guān)鍵的是miRNA5’第2?8位核苷酸序列，這被稱為“種子序列”。目前的生物信息學(xué)預(yù)測miRNA靶基因的方法正是基于上述特征，并且大多考慮了 miRNA和靶序列結(jié)合的自由能和二級結(jié)構(gòu)。我們應(yīng)用Pictar, Targetscan, mirTar, RNAhybrid等多種生物信息學(xué)算法對上述17個差異表達(dá)的miRNA潛在的靶基因進(jìn)行了預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)let_7a能調(diào)節(jié)多個與腫瘤發(fā)生相關(guān)的重要基因，包括已有文獻(xiàn)報道的Myc、Ras、HMGA2,除此之外我們還發(fā)現(xiàn)有Aurora_B。Aurora-B是目前公認(rèn)的與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的原癌基因。
[0006]Aurora-B是一功能上保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要在細(xì)胞的有絲分裂期特異表達(dá)，對染色體的濃縮、平均分配和胞質(zhì)分裂有十分重要的啟動和促進(jìn)作用。研究表明，Aurora-B的表達(dá)紊亂使細(xì)胞染色體分配異常和非整倍體的產(chǎn)生，這將進(jìn)一步啟動細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生。隨著研究的深入，臨床醫(yī)學(xué)研究開始聚焦于抑制Aimm1-B激酶活性的小分子化合物的研究和開發(fā)。PHA-739358、AZD1152-HQPA、VE-465、GSK1070916 以及 VX680是至今開發(fā)的特異性抑制Aurora家族激酶活性的化合物，體內(nèi)體外實驗表明，它們可以有效抑制肝癌、胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤的增殖和促進(jìn)腫瘤凋亡，相關(guān)藥物已分別進(jìn)入一期或二期臨床試驗。
[0007]而對于子宮內(nèi)膜組織，Aurora-B主要表達(dá)在增生層，顯示Aurora-B與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。更為重要的是，與惡性程度低的腫瘤組織相比，惡性程度高的子宮內(nèi)膜腺癌的Aurora-B的表達(dá)水平顯著升高。此外，Aurora-B的表達(dá)水平與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，提示Aurora-B與內(nèi)膜癌的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。盡管如此,有關(guān)Aurora-B與內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制研究未見有相關(guān)報道。
[0008]本發(fā)明研究miRNA在子宮內(nèi)膜腺癌發(fā)病中的作用，從全新的角度研究Aurora-B異常表達(dá)的機(jī)制。本發(fā)明的開展，有助于更好地理解疾病發(fā)生的分子機(jī)制，為發(fā)展新的子宮內(nèi)膜腺癌治療靶點和防治措施打下基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明的目的是提供一種基于微小RNA let_7a診斷子宮內(nèi)膜腺癌的方法。該方法診斷子宮內(nèi)膜腺癌簡單、可行，為發(fā)展新的治療策略打下基礎(chǔ)。
[0010]本發(fā)明提供了一種基于微小RNA let_7a診斷子宮內(nèi)膜腺癌的方法，測量來自所述受試者的測試樣品中至少一種miRNA的表達(dá)水平，將所述測試樣品中的至少一種miRNA的表達(dá)水平與所述標(biāo)準(zhǔn)樣品中至少一種miRNA的表達(dá)水平比較，所述測試樣品中miRNA的表達(dá)水平與所述標(biāo)準(zhǔn)樣品中miRNA的表達(dá)水平相比的差異指示受試者患有子宮內(nèi)膜腺癌。
[0011]本發(fā)明提供的所述基于微小RNA let_7a診斷子宮內(nèi)膜腺癌的方法，測量來自所述受試者的測試樣品中RNA let-7a的表達(dá)水平，將所述測試樣品中的RNA let_7a的表達(dá)水平與所述標(biāo)準(zhǔn)樣品中RNA let-7a的表達(dá)水平比較，所述測試樣品中RNA let_7a的表達(dá)水平與所述標(biāo)準(zhǔn)樣品中RNA let-7a的表達(dá)水平相比，let_7a在測試樣品中顯著下調(diào)，指示受試者患有子宮內(nèi)膜腺癌。
[0012]本發(fā)明提供的所述基于微小RNA let_7a診斷子宮內(nèi)膜腺癌的方法，測量來自所述受試者的測試樣品中Aimm1-B的表達(dá)水平，將所述測試樣品中的Aimm1-B的表達(dá)水平與所述標(biāo)準(zhǔn)樣品中Aurora-B的表達(dá)水平比較,所述測試樣品中Aur