一種調控楊樹不定根發育的生長素響應因子基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及調控不定根發育的生長素基因及其應用，尤其涉及一種調控楊樹不定 根發育的生長素響應因子基因 PtARF3. 1及其應用，屬于生物基因工程技術領域，楊樹不定 根生長素響應因子基因。
【背景技術】
[0002] 隨著近年來遺傳學、基因組學和分子生物學技術的發展，楊樹成為了一種研宄木 材形成、多年生植物季節變化規律、生長發育、開花、性別決定以及生物互作的模式植物。楊 樹本身是一種在全球廣泛分布的經濟樹種，具有早期速生、適應性強、分布廣、品種多、易雜 交、易改良遺傳性、易繁殖等特點，因而廣泛用于集約栽培。楊樹栽培多通過無性繁殖，硬枝 扦插最為普遍，但是目前許多優良楊樹無性系尤其是白楊派樹種扦插生根非常困難。因此 加強木本植物扦插生根機理研宄，利用分子生物學和基因工程技術，提高楊樹扦插生根能 力具有重要理論意義和應用價值。
[0003] 不定根是植物非根組織上發育的根，一般在下胚軸、莖和葉上發生，其生長發育受 外在環境和內源激素的協同作用。生長素對植物不定根發育過程起到至關重要的作用，通 過生物合成、代謝、極性運輸、信號轉導等多個途徑調控不定根起始、發生、生長等生物學過 程。在生理水平上，可以調節或影響植物不同的生理反應，如根的發生、向性運動和頂端優 勢等；在細胞水平上，它可以促進細胞的延伸、分裂和分化等。因此，分離生長素調控不定 根發育相關的關鍵基因，鑒定其生物學功能，通過遺傳改良促進難生根植物生根，是林木分 子育種重要研宄內容，不僅對林木根系發育生物學研宄有重要理論意義，而且在林木良種 無性系繁殖生產中具有潛在的應用價值。生長素與受體蛋白結合后，通過泛素化途徑降解 Aux/IAA轉錄抑制因子，激活生長素響應因子（Auxin response factor, ARF)蛋白，進而調 控生長素響應基因的表達。因此ARF轉錄因子在是生長素信號轉導系統的關鍵基因，能夠 特異地與生長素響應基因啟動子區域的生長素響應元件（AuxREs)TGTCTC結合，激活或抑 制基因的表達，調控生長素誘導的生物學過程。近年來，人們在多種草本植物中研宄發現不 同ARF基因通過調控不同的基因表達影響根系的生長發育，說明ARF基因對植物根系發育 具有重要的作用。
[0004] 目前，在木本植物中生長素響應因子調控不定根發育的機制鮮有報道，另外，木本 植物因為在進化過程中存在與草本植物不同的基因組復制事件，部分基因家族發生了擴張 或丟失，部分基因功能發生了分化。如ARF基因家族，在擬南芥中有23個成員，在楊樹中 有39個成員，其基因家族進行了擴張，部分同源基因的表達模式發生分化，因此，利用木本 植物為研宄對象，結合分子生物學和基因工程技術，解析ARFs調控楊樹不定根發育分子機 制，對于了解木本植物根系發育的分子基礎，以及通過分子育種改良難生根林木，加快林木 繁育具有重要意義。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術中存在的不足，本發明的主要目的是提供一種調控楊樹不定根系的 生長素響應因子基因 PtARF3. 1，以及楊樹生長素響應因子基因 PtARF3. 1的載體，本發明的 另一目的是提供一種調控楊樹不定根系的生長素響應因子基因 PtARF3. 1的應用。
[0006] 為實現上述目的，本發明采取以下技術方案：
[0007] -種調控楊樹不定根發育的生長素響應因子基因 PtARF3. 1，其核苷酸序列如序列 表中的序列1所示。
[0008] 一種調控楊樹不定根發育的生長素響應因子基因 PtARF3. 1的表達蛋白，其氨基 酸序列如序列表中序列2所示。
[0009] 一種含有調控楊樹不定根發育的生長素響應因子基因 PtARF3. 1的載體 PMDC32-PtARF3. 1，其核苷酸序列如序列表中的序列3,所述載體在PtARF3. 1基因的5'端組 裝組成型強表達啟動子P35S ;在PtARF3. 1基因的3'端組裝有強終止子NOS。
[0010] 一種由上述載體組裝的HPT基因可作為轉基因楊樹的篩選標記，用潮霉素進行轉 基因楊樹的篩選。所述的載體上組裝有LB序列和RB序列，LB序列和RB序列能促使組裝 于其間的PtARF3. 1基因整合至楊樹受體細胞染色體中。
[0011] 所述的楊樹生長素響應因子基因 PtARF3. 1在調控楊樹生長發育過程中的應用。
[0012] 本發明的優點：本發明以84k銀腺楊為材料，克隆了 PtARF3. 1基因。同時，構建 過量表達載體PMDC32-PtARF3. 1，該基因位于啟動子P35S之后，在啟動子P35S的驅動下， PtARF3. 1可在楊樹體內高效表達，從而調控楊樹不定根的發育。其中，PtARF3. 1基因是調 控楊樹不定根發育的關鍵基因。
[0013] 與現有技術相比，本發明通過將PtARF3. 1基因轉入楊樹，過量表達PtARF3. 1的轉 基因楊樹與野生型比較，明顯提早生根，且不定根數量明顯增多，說明PtARF3. 1基因是調 控楊樹不定根發育的關鍵調節因子，在林木基因工程領域和無性系林業領域有重要應用價 值。
【附圖說明】
[0014] 圖1是植物表達載體PMDC32-PtARF3. 1的結構示意圖。
[0015] 圖2-1和圖2-2是過量表達PtARF3. 1的轉基因楊樹與未轉基因楊樹根系比較圖； 圖2-1為未轉基因楊樹，圖2-2為轉基因楊樹。
[0016] 圖3是過量表達PtARF3. 1的轉基因楊樹的轉錄水平定量檢測圖，圖中柱形圖顯示 PtARF3. 1基因分別在野生型（84k)和轉基因楊樹（lineB、lineD、IineF)中的表達量。
[0017] 圖4-1至圖4-4是過量表達PtARF3. 1的轉基因楊樹與未轉基因楊樹，不定根發生 第5天根系比較圖；圖4-1和圖4-2為未轉基因楊樹，圖4-3和圖4-4為轉基因楊樹。
[0018] 圖5是過量表達PtARF3. 1的轉基因楊樹與未轉基因楊樹，不定根發生第5天生根 率比較圖；圖中柱形圖顯示不定根誘導第5天野生型（84k)與轉基因楊樹（lineB、lineD、 IineF)的生根率。
[0019] 圖6是采用生長素處理PtARF3. 1的轉基因株系葉片的方式檢測PtARF3. 1異位表 達促進不定根的形成是依賴生長素途徑的。
[0020] 圖7是比較野生型和PtARF3. 1的轉基因株系，分別在Omg/L IAA，lmg/L IAA，Img/ L ΙΑΑ+10 μ M NPA處理過程中的生根率統計。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明，以下實施例中未進行詳細說明的 操作可參照分子克隆，相關試劑盒使用說明的操作實現。
[0022] 實施例1克隆PtARF3. 1基因
[0023] 以 84K(P. alba X P. glandulosa)銀腺楊為材料，使用 RNeasy Plant Mini 試劑盒 和 RNase-free DNase I 試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany)提取組培苗84K 的總 RNA。每個樣 品取大約 2. Oyg RNA通過使用 Superscript III first-strand synthesis system(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)合成cDNA第一鏈。參考已發表毛果楊基因組序列，使用 Primerf軟件設計引物（擴增子包含起始密碼子及終止密碼子），進行基因全長擴增（引物 中引入GATEWAY接頭）。
[0024] 其中，PtARF3. IORF正向引物為（如序列表中序列4):
[0025] GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGAATGATAGATCTTAACACAAC,
[0026] PtARF3. IORF反向引物為（如序列表中序列5):
[0027] GGCGGCCGCACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGTACTAAAAGCACACGATGCCAC ；
[0028] 高保真PCR反應體系如下！TaKaRa高保真擴增酶PrimeSTAR 12. 5 μ 1，正向引物 (10μΜ)1 μL，反向引物（10μΜ)1 μL，模板（84Κ楊 cDNA)l μ 1，無菌 CldH2O補足至 25μ1。反 應程序：預變性 98°C，5min ;98°C，30s ;56°C，30s ;72°C，3min，10 個循環；98°C，30s ;60°C，