小rna組成的指紋圖譜在人卵巢癌診斷和治療中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明公開了一種小RNA(miRNA ;microRNA)指紋圖譜在卵巢癌診斷中的用途，屬 于生物醫學、生物工程和檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于子宮頸癌和子 宮體癌而列居第三位（Jemal等人；2011)。但卵巢上皮癌死亡率卻占各類婦科腫瘤的首位， 對婦女生命造成嚴重威脅。由于卵巢的胚胎發育、組織解剖及內分泌功能較復雜，早期癥 狀不典型，術前鑒別卵巢腫瘤的組織類型及良惡性相當困難。卵巢惡性腫瘤中以上皮癌最 多見，約占卵巢癌的80%-90%(Chan等人；2006)，其次是惡性生殖細胞腫瘤。卵巢上皮癌患 者手術中發現腫瘤局限于卵巢的僅占30%，大多數已擴散到子宮，大網膜及盆腔各器官。由 于卵巢癌的早期癥狀不明顯，鑒別其腫瘤良性、惡性很困難，只有20%的患者能夠在進行早 期診斷出來，而近80%的患者就診時已屬晚期（Ahmed等人；1996、Etzioni等人；2003和 Wright 等人；2009)。
[0003] 在卵巢癌早期診斷中，CA-125是目前研究最深入、應用最廣泛的血清腫瘤標志物， 也是普遍使用的早期診斷工具之一，但是此標志物特異性差，而且只能檢測30%的早期卵 巢癌患者，所以早期診斷依然是卵巢癌的一大難題（Menon等人；2012)。
[0004] 近年來不斷有文獻報道miRNA在腫瘤診斷和治療中的作用，卵巢癌特異性miRNA 的發現為其診斷和治療打開了一個全新的局面。miRNA是一類內源性小分子非編碼RNA，結 構高度保守，具有表達時序性和組織特異性，通過與靶基因3'非編碼區（3'UTR)互補序列 特異性結合，導致翻譯抑制或者mRNA降解，從而調芐基因表達（Bartel ;2004和Huang等 人；2010)。miRNA在惡性腫瘤中表達譜各異并發揮著重要的調控作用，隨著大規模、高通量 miRNA檢測技術的推廣應用，發現新的miRNA不僅為腫瘤的診斷和預后提供了頗具價值的 標準，同時也為尋找新的腫瘤生物治療祀標奠定了基礎（Mezzanzanica等人；2010)。
[0005] miRNA的表達水平和腫瘤細胞的分化程度密切相關，而常規的mRNA標志物不具備 此特點。Bendoraite等人通過qPCR定量卵巢癌細胞中miR-200家族的表達，發現與在其余 癌癥中報道的miR-200家族明顯低表達不同，在卵巢癌細胞中呈現高表達趨勢，通過軟件 預測和3' UTR熒光素酶報告法發現其靶標為ZEBl和ZEB2,且進一步研究發現在卵巢癌發展 模式中，卵巢表皮細胞是先從間質到上皮的轉移，這點也是與其他癌癥是先從上皮轉移到 間質過程相反（Bendoraite等人；2010)。ZEB轉錄因子是BMP信號通路的關鍵阻遏，Peart 等人發現BMP信號通路通過調節AKT酶的活性從而達到調控腹水誘導的人類卵巢表皮癌的 惡性程度（Peart等人；2012)。Li等人通過對人類轉移性漿液性卵巢癌細胞SK0V-3ip和低 轉移人漿液性卵巢癌細胞SK0V-3做miRNA表達譜芯片和熒光定量PCR驗證，發現有多條差 異表達的miRNA，特別是miR-22對卵巢癌細胞的轉移和侵襲有抑制作用（Li等人；2012)。 Xu等人還發現，過表達miR-182和miR-96靶標作用于FHB 03,對于調控卵巢癌細胞的增殖 起著顯著作用（Xu等人；2013)。Wang和他的團隊發現miR-182直接祀標負調節作用于卵 巢癌的腫瘤抑制子F1D⑶4 (Wang等人；2013)。Li等人的進一步研究發現，miR-183負調節 Tiaml的表達，從而促進卵巢癌細胞的遷移，侵襲和生長（Li等人；2012)。Stark等研究表 明，miRNA可以調節腫瘤形成，而且暗示其中的某些簇（如miR-17-92)可能是潛在的人類 原癌基因（Stark等人；2010)。
[0006] 上述這些發現可能會給藥物設計和針對性治療提供一個新的平臺。而血清作 為腫瘤生物標記物，也是研究的熱點。Li等人在2011年發現血清miRNA不受RNase、 環境、pH和低溫影響的高度穩定性也使得腫瘤患者的實際值與實驗所得結果大致一致 (Li等人；2012)。miR-21是最早發現的血清miRNA生物標記物。Taylor等人比較了良 性卵巢腫瘤血清和不同臨床分期卵巢癌血清的外周血小體中miRNA表達譜。研究發現： miR-200, miR-21，miR-141等8條miRNA高表達，而在正常對照人群中未檢測到其差異表達 (Taylor等人；2008)。因此，在外周血中這8條目標miRNA作為對無明顯癥狀的卵巢癌患 者進行篩選，作為潛在的生物標記物。Resnick等人通過TaqMan?芯片法發現卵巢癌病人血 清中，21條差異表達的miRNA，進一步通過文獻和定量結果發現:miR-21，miR-92，miR-29a， miR-126相對于在正常樣本中而目，在卵巢癌血清中是顯著1?表達的，而miR-155， miR-127，miR-99b則顯著低表達，且還發現miR-21，miR-92，miR-93在生化指標CA125正常 的卵巢癌患者中顯著高表達，反映了 miRNA可作為卵巢癌診斷的潛在生物標記物（Resnick 等人；2009)。
[0007] 盡管大量關于卵巢癌治療的研究，卵巢癌仍難于診斷和有效治療，患者中觀測到 的死亡率表明疾病的診斷、治療和預防需要改進。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于提供有效的小RNA指紋圖譜，用于卵巢癌診斷、腫瘤分級和預 后評價。
[0009] 本發明的第一方面，提供一種分離的miRNA，所述的miRNA為：
[0010] ( i )序列如SEQ ID Ν0:η所示的miRNA，其中η為選自1-3的正整數；
[0011] ( ii )與 SEQ ID NO:η 所示序列互補的 miRNA ;
[0012] ( iii )序列如SEQ ID NO: 1-3所示的miRNA中的兩種或兩種以上的組合；或
[0013] ( iv )與SEQ ID NO: 1-3所示序列互補的miRNA中的兩種或兩種以上的組合。
[0014] 本發明的第二方面，提供一種miRNA集合或組合，所述miRNA集合或組合包含序列 如 SEQ ID NO: 1-3 所示的 3 種 miRNA。
[0015] 在另一優選例中，所述miRNA集合或組合由序列如SEQ ID N0:l-6所示的6種 miRNA所構成。
[0016] 在另一優選例中，所述miRNA集合或組合由序列如SEQ ID N0:l-10所示的10種 miRNA所構成。
[0017] 在另一優選例中，所述miRNA集合或組合為由十個小RNA (HSA-MIR-1271-5P、 HSA-MIR-574-3P、HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、HSA-MIR-15B-5P、 HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P 和 HSA-MIR-135B-3P)組成的小 RNA 指紋圖譜，用于卵巢癌診斷、腫瘤分級和預后評價。
[0018] 在另一優選例中，所述miRNA集合或組合由序列如SEQ ID NO: 1-6和SEQ IDN0:11 所示的7種miRNA所構成。
[0019] 在另一優選例中，所述miRNA集合或組合為由七個小RNA (hsa-miR-182-5p、 hsa-miR-183-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-182-3p、hsa-miR-1468-5p 和 hsa-miR-135b-3p)組成的小RNA指紋圖譜，用于上皮性卵巢癌診斷、腫瘤分級和預后評價。
[0020] 在另一優選例中，所述的miRNA分離自人。
[0021] 在另一優選例中，所述的序列可通過化學合成或構建真核細胞表達載體進行表達 獲得。
[0022] 在另一優選例中，所述miRNA集合或組合還包含序列如SEQ ID NO: 12-516所示的 miRNA中的兩種或兩種以上的組合。
[0023] 在另一優選例中，所述的miRNA集合或組合包括HSA-MIR-1271-5P、 HSA-MIR-574-3P、HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、HSA-MIR-15B-5P、 HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P 和 HSA-MIR-135B-3P 中的一種或兩種 以上，用于區分卵巢癌組織和正常卵巢組織。
[0024] 在另一優選例中，HSA-MIR-1271-5P和HSA-MIR-574-3P在卵巢癌組織中表達下 調。
[0025] 在另一優選例中，所述的miRNA集合或組合包括hsa-miR-182_5p、 hsa-miR-183-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-182-3p、hsa-miR-1468-5p 和 hsa-miR-135b-3p中的一種或兩種以上，用于區分上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織。
[0026] 在另一優選例中，HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、 HSA-MIR-15B-5P、HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P 和 HSA-MIR-135B-3P 在卵巢癌組織中表達上調。
[0027] 在另一優選例中，所述的miRNA集合或組合包括425種在卵巢癌組織和正常卵 巢組織中表達倍數差異大于2的miRNA，其中204種上調（hsa-miR-522、hsa-miR-429、 hsa-miR-141_5P、hsa_miR-200a、hsa-miR-96_5P、hsa-miR-183_5P、hsa_miR-449c、 hsa-miR-205 和 hsa-miR-182-5P 最顯著，差異倍數大于 10) ;221 種下調（hsa-miR-202-3p、 hsa-miR-4711-3p、hsa-miR-4778-5p、hsa-miR-4510、hsa-miR-4789-5p、hsa-miR-4760-3p、 hsa-miR-4804_5p，hsa-miR-4770、hsa-miR-4781_3p、hsa-miR-4738_5p、hsa-miR-4777_5p、 hsa-miR-4696和hsa-miR-4678最顯著，差異倍數大于10);由此區分卵巢癌組織和正常卵 巢組織。
[0028] 在另一優選例中，所述的miRNA集合或組合包括489種在上皮性卵巢癌組 織和正常卵巢組織中表達倍數差異大于2的miRNA，其中241種上調（hsa-miR-522、 hsa-miR-429、 hsa-miR-96_5P、 hsa-miR-205、 hsa-miR-141_5P、 hsa-miR-183_5P、 hsa_miR-200a、 hsa-miR-182_5P、 hsa_miR-519a、 hsa_miR-200c、 hsa_miR-449c、 hsa-miR-182_3p、hsa-miR-135b_3p 和 hsa_miR-1274a 最顯著，差異倍數大于 10); 248 種下調（hsa-miR-202_3p、hsa-miR-4778_5p、hsa-miR-4711_3p、hsa-miR-4510、 hsa-miR-4777-5p、hsa-miR-4738-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4789-5p、hsa-miR-4804-5p、 hsa-miR-4696, hsa_miR-476〇-3p、hsa-miR-4781_3p、hsa-miR-4524_3p、hsa-miR-4759 和 hsa-miR-4719最顯著，差異倍數大于10);由此區分上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織。
[0029] 本發明的第三方面，提供一種分離的或人工構建的前體miRNA，所述的前體miRNA 能在人細胞內剪切并表達成權利要求1所述的miRNA。
[0030] 本發明還提供一種分離的或人工構建的前體miRNA集合或組合，所述的前體 miRNA集合或組合中的前體miRNA能在人細胞內剪切并表達成第二方面所述的miRNA集合 或組合中的miRNA。
[0031] 本發