阿司匹林抵抗相關的p2y1基因多態性位點及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫學疾病治療藥物選擇領域，具體涉及阿司匹林抵抗相關的P2Y1基 因多態性位點及應用。 技術背景
[0002] 隨著我國人口老齡化，腦血管病發病率逐年攀升，最新調查結果表明從2010年起 腦血管病已成為超越腫瘤危害中國人健康的第一大殺手，每年我國新發病例200萬，缺血 性腦血管病占70~80%，復發患者占27%，70%的患者留有神經功能缺損，腦血管病的高 致死率、致殘率和復發率已造成了極大的社會負擔和經濟負擔。抗血小板藥物（尤其是阿 司匹林）在腦血管病的防治中起著至關重要的作用，但是目前的調查結果表明很多腦血管 病患者即使服用了抗血小板藥物，仍然反復再發卒中，這種現象稱為抗血小板藥物抵抗。
[0003] 抗血小板藥物抵抗與諸多因素相關，如腦血管病相關危險因素（性別、糖尿病、吸 煙、代謝綜合征、急性冠脈綜合征、既往心血管事件、肝腎功能異常、血液系統疾病等），患者 依從性或藥物劑量，藥物相互作用及基因多態性等。其中基因多態性是目前研宄熱點。既 往研宄發現，在體內影響阿司匹林作用的多個環節的因子存在基因多態性，這種多態性直 接影響其功能，從而使得不同個體服用阿司匹林后對血小板的反應不同。據不完全統計，臨 床阿司匹林抵抗的患者高達40%，但是因為影響阿司匹林作用的靶點眾多，到目前為止，阿 司匹林抵抗相關的基因多態性還不確定。但是阿司匹林作為缺血性腦血管疾病二級預防的 重要藥物，盡快明確阿司匹林抵抗相關基因多態性至關重要。
[0004] P2Y1是血小板表面G蛋白偶聯受體，ADP通過P2Y1和P2Y12受體刺激血小板的激 活和聚集。基于申請人最近的研宄，申請人明確了一個與阿司匹林抵抗相關的P2Y1基因多 態性位點：P2Y1 (A745G)，該位點可用于為缺血性卒中患者選擇抗血小板藥物，降低阿司匹 林抵抗及卒中復發率。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供了阿司匹林抵抗相關的P2Y1基因多態性位點：A745G。該 位點位于人P2Y1基因全長的第745位，其堿基為A或G，攜帶有P2Y1突變體745G等位基因 的患者與野生型A745患者相比，更易出現阿司匹林抵抗。
[0006] 本發明的另一個目的在于提供了檢測阿司匹林抵抗相關P2Y1基因多態性位點 A745G的引物。
[0007] 本發明最后一個目的在于提供了基于P2Y1基因多態性位點A745G的引物在制備 篩選阿司匹林抵抗患者試劑盒中的應用。該試劑盒可用于篩選阿司匹林抵抗患者，以便更 好的為缺血性卒中患者選擇抗血小板藥物，降低阿司匹林抵抗及卒中復發率。
[0008] 為了實現上述目的，本發明采用以下技術措施：
[0009] 與阿司匹林抵抗相關的P2Y1基因多態性位點，該位點是在人P2Y1基因的745位 發生了 A - G的突變，經檢測攜帶有P2Y1突變體745G的患者更容易發生阿司匹林抵抗。基 于P2Y1基因的A745G位點設計引物，然后對該位點進行檢測。
[0010] 本發明的保護內容還包括檢測阿司匹林抵抗相關P2Y1基因多態性位點A745G的 引物，該引物只要是基于P2Y1基因的A745G位點設計的引物，并能成功擴增出包括P2Y1基 因的A745G的DNA片段的，均為本發明的保護內容。
[0011] 優選的，根據上述P2Y1基因多態性位點A745G設計的引物為：
[0012] 正義鏈：5 '-CACGGGTGGCCATGTCGC-3'
[0013] 反義鏈：5 '-TACCAGGTAAATCGATTT-3' ；
[0014] 或
[0015] 正義鏈：5 '-CACATGGGGGAGTTCAGG-3'
[0016] 反義鏈：5 '-AACAGTCAGTACAATGAT-3' ；
[0017] 或
[0018] 正義鏈：5 '-ACAAAGACTGTACGTAGT-3' ；
[0019] 反義鏈：5 '-GTCACCTGATACGTGGCA-3'。
[0020] 基于P2Y1基因多態性位點A745G的引物在制備篩選阿司匹林抵抗患者試劑盒中 的應用，包括利用P2Y1 (A745G)位點引物對缺血性卒中患者的DNA進行檢測，若檢測到攜帶 有P2Y1突變體745G的患者，則該患者有更易產生阿司匹林抵抗的趨勢，檢測方法包括但不 限于目前已有的針對SNP位點的檢測技術。
[0021] 包括利用本發明提供的P2Y1 (A745G)位點引物，與其他阿司匹林抵抗相關的多態 性位點引物結合組成的試劑盒，對患者的DNA進行檢測，來篩選更易產生阿司匹林抵抗的患 者。所述的其他與阿司匹林抵抗相關的多態性位點為：人COX-I基因多態性位點（A842G)， 引物為：正義鏈：5 ' -AAGCCTTATTAGAGGGTA-3 '，反義鏈：5 ' -TACTTTGACGCCGGTGGG-3 ' ；和 人GP I a基因多態性位點（C807T)，引物：正義鏈：5'-TTCCTTAACTGTTACTTC-3'，反義鏈： 5 '-CTGTGCCATCTCCTATTT-3'。
[0022] 所述的其他與阿司匹林抵抗相關的多態性位點或為：人GP I a基因多態性位點 (C807T)，引物：正義鏈：5 '-TTCCTTAACTGTTACTTC-3'，反義鏈：5 '-CTGTGCCATCTCCTATTT-3' 和人GP III a基因多態性位點（A1166C)，引物：正義鏈：5 '-TGTCAGACACTACACTCA-3'，反義 鏈：5 '-GGATAATCCTAGGAAAAT-3'。
[0023] 與現有技術相比，本發明具有以下特點：
[0024] 1)本發明提供的P2Y1基因多態性位點（A745G)與阿司匹林抵抗相關，意在為缺血 性卒中患者更好的選擇抗血小板藥物，降低卒中復發率。
[0025] 2)本發明提供的針對檢測P2Y1基因多態性位點A745G的引物，意在制備篩選阿司 匹林抵抗的患者的試劑盒。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。本發明所述技術方案，如未特別說 明，均為本領域的常規方案。
[0027] 實施例1 :
[0028] 與阿司匹林抵抗相關的P2Y1基因多態性位點（A745G)的發掘：
[0029] 從卒中數據庫中調取2010~2014年卒中患者數據，根據缺血性卒中診斷標準，篩 選確診為缺血性卒中患者，并且進一步選取明確服用阿司匹林作為二級預防（二級預防是 針對已經有腦卒中癥狀或已發生卒中后的患者而言，這些人需要預防再次發生腦卒中）的 患者為研宄對象作為總樣本（共5033人）。
[0030] 1.明確總樣本中卒中復發的人數，探討總樣本中P2Y1(A745G)基因的多態性與卒 中復發的關系（表2);
[0031] 2.總樣本中，回院復診患者（包括已復發的和未復發的患者，共3429人），采集患 者外周血，采用VerifyNow儀器檢測阿司匹林反應單元（ARU)，確定ARU彡550的人數，探討 P2Y1 (A745G)基因的多態性與ARU彡550的關系（表1)。
[0032] 本發明實施例中中，以下兩種情況任意一種發生均視為發生阿司匹林抵抗：
[0033] 1.若患者服用阿司匹林期間，仍然發生卒中，則定義為阿司匹林抵抗；
[0034] 2.采用VerifyNow儀器檢測阿司匹林反應單元（ARU)，如果ARU彡550,則定義為 血小板高反應性，表明這個患者存在阿司匹林抵抗。
[0035] 結果表明，服用阿司匹林進行二級預防的缺血性卒中患者中，與野生型患者相比， P2Y1 (A745G)突變型組患者阿司匹林反應單元ARU值明顯高，且ARU彡550患者人數明顯高 于野生型組（表1);同時卒中復發率也明顯高（表2)。
[0036] 本實施例中針對P2Y1 (A745G)基因的多態性的檢測通過以下方法實現：
[0037] 針對P2Y1基因多態性位點（A745G)設計引物如下：
[0038] 正義鏈：5 '-CACGGGTGGCCATGTCGC-3'
[0039] 反義鏈：5 '-TACCAGGTAAATCGATTT-3'。
[0040] 以患者總DNA為模板，利用常規PCR進行擴增，擴增片段長度為350bp，測序，檢測 擴增片段的第185個堿基。野生型患者的DNA序列為SEQ ID NO. 1所示，突變型患者的DNA 序列為SEQ ID NO. 2所示。采用該對引物擴增出的序列中第185個堿基對應P2Y1基因中 的第745位點。
[0041] 表1 P2Y1 (A745G)野生型患者與突變型患者ARU值
[0042]
[0043] 表2 P2Y1(A745G)野生型患者與突變型患者卒中復發率
[0044]
[0045] 結果表明，基于該位點設計的引物可用于P2Y1(A745G)突變型患者的篩選，以便 更好的為缺血性卒中患者選擇抗血小板藥物，降低阿司匹林抵抗及卒中復發率。
[0046] 實施例2 :
[0047] 與阿司匹林抵抗相關P2Y1基因多態性位點（A745G)引物在制備篩選阿司匹林抵 抗患者試劑盒中的應用：
[0048] 對所有首次發生缺血性卒中患者，給予阿司匹林進行二級預防，3個月后對患者進 行隨訪，檢測每個患者ARU，及卒中復發情況。同時取患者外周血通過基因測序檢測患者是 否存在P2Y1 (A745G)多態性，分析突變型和野生型患者阿司匹林抵抗發生率。
[0049] 從2013年8月開始研宄，病例納入截止時間為2014年8月，根據缺血性卒中診斷 標準，選取確診為缺血性卒中患者作為研宄對象，完成以下工作：
[0050] 1.根據缺血性卒中二級預防指南，給予所有患者阿司匹林進行二級預防；
[0051] 2.所有患者在啟動二級預防90天時進行隨訪，檢測隨訪研宄對象的ARU及卒中復 發情況；
[0052] 3.采取患者外周血，利用本發明提供的引物（正義鏈： 5 ' -AAGCCTTATTAGAGGGTA-3 ' ；反義鏈：5 ' -TACTTTGACGCCGGTGGG-3 '，進行 PCR 擴增，測序， 擴增出的片段全長350bp，其中第185位堿基對應P2Y1基因的第745位點。因此，通過對擴 增的序列第185位堿基進行判斷，檢測患者是P2Y1(A745)野生型還是P2Y1(745G)突變型。
[0053] 4.分析突變型和野生型患者ARU值和卒中復發率。
[0054] 結果表明，服用阿司匹林進行二級預防的缺血性卒中患者中，與P2Y1(A745)野生 型患者相比，P2Y1 (745G)突變型組患者ARU值更高，且ARU彡550患者人數明顯高于野生 型組（表3)，卒中復發率也明顯高（表4)。
[0055] 表3 P2Y1 (A745G)野生型患者與突變型患者ARU值
[0056]
[0057] 表4 P2Y1(A745G)野生型患者與突變型患者卒中復發率
[0058]
[0059] 實施例3 :
[0060] 與阿司匹林抵抗相關其他基因多態性位點的發掘：
[0061] 1)與阿司匹林抵抗相關的COX-I基因多態性位點（A842G)的發掘：
[0062] 以實施例1同樣的卒中數據庫，血液樣本和方法，檢測總樣本（共5033人，與實施 例1相同）中COX-I (A842G)基因的多態性與卒中復發的關系（表6);及回院復診患者（包 括已復發的和未復發的患者，共3429人，與實施例1相同）中COX-I (A842G)基因的多態性 與ARU彡550的關系（表5)。
[0063] 結果表明，服用阿司匹林進行二級預防的缺血性卒中患者中，與野生型患者相比， COX-I (A842G)突變型組患者阿司匹林反應單元ARU值明顯高，且ARU彡550患者人數明顯 高于野生型組（表5);同時卒中復發率也明顯高（表6)。
[0064] 本實施例中針對COX-1 (A842G)基因的多態性的檢測通過以下方法實現：
[0065] 針對C0X-1基因多態性位點（A842G)設計引物如