一種發狀念珠藻基因組dna的提取方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物學研宄的基礎技術領域，具體涉及一種高純度發狀念珠藻基因組 DNA的提取方法。
【背景技術】
[0002] 發菜（Nostoc flagelliforme)，又稱發狀念珠藻，是藍菌門念珠藻目的細菌，廣泛 分布于我國的沙漠和貧瘠土壤中，因其色黑而細長，如人的頭發而得名。發菜富含各種營養 物質，尤其是發菜胞外多糖和發菜藻藍蛋白，具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、抗凝血等功能， 食用和藥用價值很高。日本微細藻類綜合研宄所和富山醫科藥科大學的藥理試驗結果表 明，發菜多糖對單純皰瘆病毒等具有明顯的抗病毒活性。
[0003] 由于發菜生長環境的特殊性和人工培育技術的滯后，原料短缺成為提取其功能活 性物質工業化的瓶頸。近年來，科研工作者采用基因工程技術等手段構建產發菜活性物質 的重組工程菌株，為直接轉化生產其活性物質開辟了一條新途徑。要實現這一途徑，關鍵是 要獲取高純度的發菜基因組DNA，目前DNA提取方法主要有高鹽低pH法、SDS裂解法、植物 基因組DNA提取試劑盒等。Rodrigo等利用CTAB法提取了珊瑚藻基因組DNA。Christine等 和Jang-Seu等分別用植物DNA試劑盒提取了衣藻Chlamydomonas和甲藻Dinoflafellate 的DNA，并對提取的DNA進行了分析。Elena等和Mo等也對一些微藻DNA進行提取研宄。這 些方法雖然可以提取到一定量的DNA，但是產率低，純度差。
[0004] 由于發狀念珠藻的特殊性，故單純地重復采用以上任何一種方法均不能很好地排 除胞外多糖、蛋白質、酚類等物質的干擾。這些物質的存在給DNA的提取和后續實驗帶來極 大的困難。如胞外多糖能抑制連接酶、聚合酶的生物酶活；蛋白質存在會造成DNA純度下 降；酚類物質氧化可引起DNA降解、變色，影響后續試驗的進行。另外，實驗室常用的植物 基因組DNA提取試劑盒是離心柱型試劑盒，需過吸附柱，DNA得率低，純度差，樣品的花費較 尚。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種發狀念珠藻基因組DNA的提取方法，可以獲得OD26tl/ OD28tl比值在1. 8左右的高純度發狀念珠藻基因組DNA。
[0006] 為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：
[0007] 該提取方法包括以下步驟：
[0008] 1)離心收集發狀念珠藻培養細胞，依次用無菌水、質量分數0.8~1.2%的NaCl 水溶液以及無菌水清洗所述細胞；
[0009] 2)經過步驟1)后，對所述細胞進行破壁，然后離心收集破碎后的細胞；
[0010] 3)稱取0. 1~0. 3g所述破碎后的細胞并轉入裝有2000~4000 μ L 65°C預熱提 取液的離心管中，充分混勻后置于65°C水浴中50~70min，其間搖動所述離心管若干次，得 混合物；所述提取液的制備方法為：向無菌水中加入Tris-HCl母液、EDTANa2、NaCl、巰基乙 醇以及CTAB，得到含有100~105mMTris-HCl、20~22mMEDTANa2、1.4~1.5MNaCl、體積 分數0. 2~0. 25 %的巰基乙醇以及質量分數2. O~2. 2 %的CTAB的混合溶液，然后用NaOH 調節混合溶液的pH至8. 0,得提取液；
[0011] 4)向混合物中加入氯仿與異戊醇的混合液并翻動至不分相，然后離心并收集上清 液；所述氯仿與異戊醇的體積比為24:1 ;
[0012] 5)對上清液按照步驟4)重復處理1~2次，向最后一次得到的上清液中加入異丙 醇，然后于_18~_20°C靜置30~45min ;
[0013] 6)離心收集步驟5)中靜置過程析出的白色沉淀，依次用500~800 yL 75%乙醇 和60~90 μ L I. 5mol/L的NaAc水溶液的混合液、75%乙醇以及無水乙醇洗滌白色沉淀， 洗滌后自然風干。
[0014] 所述步驟1)中依次用無菌水、質量分數1. 0%的NaCl水溶液以及無菌水清洗所述 細胞各2次，每次清洗后于4°C以及4000~6000r/min下離心8~12min收集細胞。
[0015] 所述破壁的方式為采用玻璃勻漿器進行2~3次勻漿。
[0016] 所述提取液各組分的濃度為：100mM Tris-HCl、20mM EDTANa2U. 4M NaCl、體積分 數0. 2%的巰基乙醇以及質量分數2. 0%的CTAB，所述提取液的pH為8. 0。
[0017] 所述提取方法具體包括以下步驟：
[0018] a)離心收集處于生長對數期的發狀念珠藻純培養細胞，將所述細胞依次用無菌水 清洗2次、質量分數I. 0%的NaCl水溶液清洗2次，再用無菌水清洗2次，每次清洗后于4°C 以及4000~6000r/min下離心8~12min收集細胞；
[0019] b)用玻璃勻漿器對經過步驟a)清洗后的細胞進行二次勻漿破壁，然后于4°C以及 4000~6000r/min下離心8~12min并收集沉淀于底部的破碎后的細胞；
[0020] c)稱取0. 1~0. 3g所述破碎后的細胞并轉入裝有2000~4000 μ L 65°C預熱提 取液的離心管中，充分混勻后置于65°C水浴中50~70min，其間每隔15min搖動所述離心 管1次，得混合物；所述提取液的制備方法為：向無菌水中加入Tris-HCl母液、EDTANa2、 NaCl、巰基乙醇以及 CTAB，得到含有 IOOmM Tris-HCl、20mM EDTANa2U. 4M NaCl、體積分數 0. 2%的巰基乙醇以及質量分數2. 0%的CTAB的混合溶液，然后用NaOH調節混合溶液的pH 至8. 0,得提取液；
[0021] d)向混合物中加入氯仿與異戊醇的混合液并翻動至不分相，然后離心并收集上清 液；所述氯仿與異戊醇的體積比為24:1 ;
[0022] e)對上清液按照步驟d)重復處理1~2次，向最后一次得到的上清液中加入異丙 醇，然后于_20°C靜置30~45min ;
[0023] f)通過4°C以及12000r/min下離心8~12min收集步驟e)中靜置過程析出的白 色沉淀；
[0024] g)用500~800 μ L 75%乙醇和60~90 μ L I. 5mol/L的NaAc水溶液使白色沉 淀懸浮后靜置30min，然后于4°C以及6000~9000r/min下離心10min，棄上清液；
[0025] h)將步驟g)離心得到的沉淀用800 μ L 75%乙醇懸浮后靜置30min，然后于4°C 以及6000r/min下離心10min，棄上清液；
[0026] i)將步驟h)離心得到的沉淀用無水乙醇懸浮后靜置30min，然后于4°C以及 6000r/min下離心10min，棄上清液并自然風干沉淀。
[0027] 與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
[0028] (1)本發明采用無菌水、NaCl水溶液和無菌水清洗細胞的方式，使細胞表面的雜 質和胞外多糖含量降到最低，減少培養液中營養物質（如無機鹽）和糖類對提取DNA的污 染，減少殘糖對后續PCR、酶切等抑制作用；
[0029] (2)本發明使用所述提取液提取發狀念珠藻基因組DNA，其OD26Q/OD 28Q比值均在 1. 8左右，純度良好，且PCR驗證試驗獲得了條帶清晰、重復性好的擴增結果，同時該提取液 的毒性大大降低。
[0030] (3)與植物試劑盒提取方法相比，具有試驗步驟少，操作簡單，試劑易得，提取成本 低，電泳條帶單一、清晰、無彌散等特點，提取的基因組DNA可直接用于PCR、基因重組等高 精度的分子生物學實驗研宄。
[0031] 此外，離心收集處于生長對數期的發狀念珠藻純培養細胞，可以減少直接采用野 生發菜提取對DNA造成的污染。本發明使用玻璃勻漿器二次勻漿破壁的方式，破壁效果好， 細胞破碎率高，也避免了液氮的使用，環保節能。
【附圖說明】
[0032] 圖Ia為本發明方法提取發菜基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，左起第1泳道（M): 23000-bp marker ;第2-11泳道：不同發狀念珠藻樣品DNA。
[0033] 圖Ib為采用植物試劑盒提取法提取發菜基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，左起第1 泳道（M) :23000-bp marker ;第2-11泳道：不同發狀念珠藻樣品DNA。
[0034] 圖2為PCR擴增產物檢測結果圖，左起第1泳道（M) :4500-bp marker ;第2-5泳 道：以純度較好的NH-01、NH-02、NH-03、NH-06DNA為模板的PCR產物電泳結果。
【具體實施方式】
[0035] 下面結合附圖和實施例對本發明做詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限 定。
[0036] (一）高純度發狀念珠藻基因組DNA的提取方法，包括以下步驟：
[0037] (1)于4°C、4000~6000r/min離心8~12min,收集處于生長對數期的發狀念珠 藻純培養細胞（樣品數量10份），依次用無菌水清洗細胞2次，質量分數1. 0%的NaCl水 溶液清洗細胞2次，再用無菌水清洗2次，6000r/min(4°C )離心10min收集細胞；
[0038] (2)用玻璃勻漿器二次勻漿法對細胞進行破壁，6000r/min (4°C )離心10min收集 沉淀于管底的破碎后的細胞（破碎率85%以上）；
[0039] (3)稱取0.3g破碎后的細胞轉入65°C預熱的4000 yL提取液（裝于離心管 內）中，充分混勾，65°C水浴45min，其間（指置于65°C水浴過程中）每隔15min輕輕搖 動離心管1次，得混合物；提取液用無菌水配制，各組分的濃度為：100mM Tris-HCl、20mM EDTANa2U. 4M NaCl、體積分數0. 2%的巰基乙醇、質量分數2. 0%的CTAB，提取液pH = 8. 0 ; Tris-HCl母液配制：取24. 2g Tris用無菌水定容至200mL，然后用鹽酸調節pH至8. 0 ;
[0040] (4)向混合物中加入同體積的混合液氯仿：異戊醇（體積比為24:1)，輕輕翻動至 液面混池而無兩相，8000