一種制備葡萄潰瘍病菌分生孢子的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種制備葡萄潰瘍病菌分生孢子的方法。
【背景技術】
[0002] 由葡萄座腔菌科真菌引起的葡萄潰瘍病近年來在我國的葡萄主產區均有發生， 病原菌侵染葡萄的果實、枝干等部位引起葡萄果梗干枯、枝干潰瘍等癥狀，造成樹勢減弱 甚至整株死亡，給葡萄生產帶來了不同程度的損失（Ji-Ye Yan，Yue Xie，Wei Zhang.，et al. Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback in China. Fungal Diversity，2013,61 (I) :221-236.)。在我國4種葡萄座腔菌科真菌能夠引起葡萄潰瘍病， 其中Lasiodiplodia theobromae是其中的優勢種且致病力較強，其制備的孢子懸浮液是種 類鑒定、致病性測定和侵染機理研宄的前提（Yan J Y，Li X H. Occurrence of grapevine trunk disease caused by Botryosphaeria rhodina in China. Plant Disease，2011， 95(2) :219.)。試驗中由于在同一培養基上不斷的用菌絲頻繁的轉接，Lasiodiplodia theobromae菌株出現產孢量降低、致病力退化等問題，給后續致病性測定、致病機理研宄等 帶來了困難。因此，如何建立一種快速、高效的大量獲取分生孢子及制備孢子懸浮液的方法 是一個亟待解決的技術問題。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種制備葡萄潰瘍病菌（Lasiodiplodia theobromae)分生 孢子的方法，該方法可提高葡萄潰瘍病菌（Lasiodiplodia theobromae)分生孢子產量，以 快速、有效的制備孢子懸浮液。
[0004] 本發明的方法通過優化誘導產孢條件及制備孢子懸浮液的過程以快速獲得數量 大、致病力強的孢子懸浮液。
[0005] 基于上述發明目的，本發明的制備葡萄潰瘍病菌（Lasiodiplodia theobromae)分 生孢子的方法，包括以下步驟：
[0006] 1)將葡萄潰瘍病菌接種到PDA培養基上，在每天11-13小時光照的條件下，于 25-28?培養箱中培養至菌落生長旺盛；
[0007] 2)選取對葡萄潰瘍病菌敏感的葡萄品種作為接種材料，將健康的葡萄綠枝條剪成 28-32cm，先表面消毒，再用無菌水沖洗，于滅菌的濾紙上瞭干；
[0008] 3)用滅菌的打孔器在步驟2)中處理的綠枝條上打孔，去掉韌皮部；將步驟1)培 養獲得的菌落用滅菌的打孔器制備菌絲塊，將制備好的菌絲塊接種于打孔處，用封口膜包 裹菌絲塊保濕，并將接種過的枝條插入裝有無菌水的組培瓶內，于28-30°C、每天11-13小 時光照的條件下培養；其中，在相對濕度大于90%的條件下培養36-48小時，然后濕度維持 在70-80%，培養5-10天。
[0009] 上述方法中，所述對葡萄潰瘍病菌敏感的葡萄品種為夏黑品種葡萄。
[0010] 上述方法中，步驟1)中，所述菌落生長旺盛為菌落直徑生長至整個培養皿直徑的 7/9-8/9 ;優選的，所述菌落生長旺盛為用9cm的培養皿培養菌株，菌落生長直徑為7-8cm。 一般的，培養時間為2-4天，具體可以為3天。
[0011] 上述方法中，步驟1)中，所述的光照條件優選在每天12小時光照12小時黑暗的 條件。
[0012] 上述方法中，步驟2)中，所述打孔器的打孔直徑為5-8mm ;打孔位置沿著菌落邊 緣。
[0013] 上述方法中，步驟2)中，優選將健康的葡萄綠枝條剪成30cm長的枝條，一般是包 括2-3節的枝條段。
[0014] 上述方法中，步驟2)中，所述表面消毒是用次氯酸鈉消毒，所述次氯酸鈉的質量 百分濃含量為1% -3%，消毒的時間是1-3分鐘。所述無菌水沖洗優選沖洗三遍。
[0015] 所述的方法中，步驟3)中，所述打孔器的打孔直徑為5mm，打孔的位置選取枝條的 中部。這樣，有利于病斑擴展。
[0016] 所述方法中，步驟3)中，將接種過的枝條插入裝有無菌水的組培瓶內，于28°C、每 天12小時光照12小時黑暗的條件下培養。
[0017] 所述方法中，所述步驟3)中的封口膜可以為塑料或樹脂材質的等透明不透氣的 薄膜，為了操作方便，可以選擇韌性較好的封口膜等，如美國Parafilm封口膜。所述方法中 還包括將獲得的分生孢子制備孢子懸浮液的方法：用剪刀將步驟3)中布滿小黑點的葡萄 枝條剪成〇. 5cm大小，放入裝有I. 5ml無菌水的離心管中，組織研磨l-2min，在振蕩器上震 蕩lmin，使分生孢子器破裂釋放出孢子，然后過濾除去枝條殘體和菌絲，濾液即為葡萄潰瘍 病菌的孢子懸浮液。
[0018] 所述的組織研磨采用研磨槍進行組織研磨。
[0019] 所述過濾除去枝條殘體和菌絲的方法采用2層脫脂紗布過濾。
[0020] 上述方法，在接種3-5天內接種部位形成黑色的梭形潰瘍斑，5-7天枝條上布滿黑 色的小點-分生孢子器，鏡檢觀察內部有大量的分生孢子產生。
[0021] 本發明的方法，首先將葡萄潰瘍病菌用PDA培養基25-28°C培養箱中培養2-4天， 菌絲生長旺盛時用滅菌的打孔器制備菌絲塊，將菌絲塊接種于經1 %次氯酸鈉處理的對 葡萄潰瘍病菌敏感的葡萄綠枝條上，用封口膜包裹保濕并插入裝有無菌水的組培瓶內，在 28°C、12h光照/黑暗交替、相對濕度在70% -80%的人工氣候箱中培養5-7天，待枝條上布 滿小黑點時即有大量的分生孢子產生。而后將枝條剪成〇. 5cm小段，放入裝有I. 5ml無菌 水的離心管中，經研磨、震蕩和過濾得到葡萄潰瘍病菌的孢子懸浮液。
[0022] 本發明的方法誘導產生分生孢子所需時間短、孢子數量多、且致病力強。
[0023] 另外，該方法簡便易行，誘導產生分生孢子所需時間短、孢子數量多且致病力強， 解決了菌絲繼代培養帶來的產孢量降低、致病性退化等問題。從發病枝條上產生的小黑點 經研磨、震蕩、過濾制備的孢子懸浮液由于誘導產孢時間相對固定、集中，孢子生長狀態基 本一致，克服了孢子懸浮液中老幼孢子同時存在帶來的試驗誤差，同一（或不同）批次制備 的孢子懸浮液孢子量差異小，質量更為穩定。且試驗中保濕培養介質用無菌水取代了營養 液或營養土，經濟成本降低。
[0024] 總之，本發明的方法進行葡萄潰瘍病菌的誘導產孢，為短時間內獲取大量的分生 孢子和制備孢子懸浮液提供了一種簡易、高效的方法，且制備的孢子懸浮液孢子差異小，質 量穩定、致病力強，為葡萄潰瘍病菌的致病性測定、群體遺傳分化和致病機理解析等提供了 保證。
【附圖說明】
[0025] 圖1為葡萄綠枝條誘導產孢裝置。
[0026] 圖2為綠枝條病變出現梭形病斑。
[0027] 圖3為病斑部位的小黑點-分生孢子器（A為30 X顯微鏡下分生孢子器，B為60 X 顯微鏡下分生孢子器）。
【具體實施方式】
[0028] 為了更好的理解本發明，下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。
[0029] 下述實施例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0030] 下述實施實施例中所用葡萄潰瘍病菌菌株（Lasiodiplodia theobromae)GX-5_5A 在文獻"Ji-Ye Yan, Yue Xie, Wei Zhang.，et al. Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback in China. Fungal Diversity. 2013,61 :221-236. "中公 開過，公眾可從北京市農林科學院獲得。
[0031] 實施例1、葡萄綠枝條篩選
[0032] 本發明通過篩選試驗，篩選出對葡萄潰瘍病菌敏感，并且適于產生分生孢子的葡 萄品種，通過實驗證明，夏黑葡萄是最優選的葡萄品種。具體試驗如下所述：
[0033] (1)將保存的葡萄潰瘍病菌菌株（Lasiodiplodia theobromae) GX-5-5A 在 9cm 的 PDA培養基平板上活化，在28°C、12h光照/12h黑暗的培養箱中培養3天，待菌落生長至7cm 時備用。
[0034] (2)把步驟（1)中培養好的菌落用5mm滅菌的打孔器沿菌落邊緣打取菌絲塊。
[0035] (3)選取表1中所示的蜂后、巨玫瑰、夏黑等葡萄品種的綠枝條，剪成30cm包括 2-3節的枝條段，用質量百分含量為1 %的次氯酸鈉表面消毒lmin，再用無菌水沖洗3遍，于 滅菌的濾紙上晾干。
[0036] (4)用5_的打孔器在晾干的綠枝條上的中間部位打孔，去掉韌皮部。將步驟2中 制備好的菌絲塊接種于打孔處，用封口膜（美國Parafilm)包裹并插入裝有滅菌蛭石