枯草芽孢桿菌jn005及其在防治水稻稻瘟病中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物防治技術領域，具體地說，涉及一種枯草芽孢桿菌JN005及其在 防治水稻稻瘟病中的應用。
【背景技術】
[0002] 水稻（Oryza sativa)是最重要的糧食作物之一，全球有半數以上人口以水稻為 食。稻瘟病（病菌為Magnaporthe oryzae，其無性世代為Pyicularia oryzae)是水稻最 嚴重要的真菌性病害之一。稻瘟病菌（Eoryzae)是一種半活體寄生，在感染最初階段具 有很明顯的活體營養階段。稻瘟病根據其發病部位和發病時期不同可以分為苗瘟、葉瘟、 節瘟、穗瘟、谷粒瘟、枝梗瘟等。目前生產上主要利用抗病品種和使用化學殺菌劑控制稻瘟 病。主要使用的殺菌劑有三環唑、稻瘟靈、咪鮮胺、稻瘟酰胺、異稻瘟凈、稻瘟凈、敵瘟磷（克 瘟散）、丙環唑、嘧菌酯、戊唑醇、烯丙苯噻唑、氯溴異氰尿酸、三氯異氰尿酸、四氯苯酞、肟 菌·戊唑醇（拿敵穩）、硫磺·三環唑、甲硫?三環唑（稻津）、異稻?稻瘟靈、丙環唑?咪 酰胺等；生物產品化學有效成分或活體微生物如春雷霉素、乙蒜素、氨基寡糖素、枯草芽孢 桿菌、解淀粉芽孢桿菌等。由于稻瘟病菌的遺傳背景復雜，易變異，加上抗瘟品種單一化，主 栽品種的遺傳同質性高，抗病品種難保持持久抗稻瘟病，常常導致一個新的抗瘟品種在大 面積種植幾年后喪失抗性，而感病化。在抗病品種不能滿足生產需要的情況下，化學防治是 防治稻瘟病的有效手段，但由于用藥不合理，給生態安全帶來潛在的不利影響，也值得人們 關注。
[0003] 生物防治即利用有益微生物活體或代謝產物殺滅或者降低病原微生物的數量以 控制植物病害發生和危害。從植物病害的可持續控制來考慮，生物防治是一類綠色安全有 效的防治措施。
[0004] 然而，生物防治領域中常會遇到拮抗微生物在田間自然條件下定殖力差、對病害 防治效果不穩定等問題。大量的研宄也表明，室內篩選出的拮抗微生物在溫室中對病原菌 有較強的抑制作用，而在大田防治中效果不理想，這可能是由于一方面菌株不適應大田生 態環境而不能很好的定殖到植物的根圍，另一方面與大田土壤中復雜的微生物種類與拮抗 菌株之間出現相互作用，導致拮抗微生物防效降低，因此，選擇篩選生物菌株的田間適應能 力強或高效代謝產物應用于大田病害防治是解決上述問題的重要途徑。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一株新分離的生防菌-枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis) JN005〇
[0006] 本發明的另一目的是提供所述枯草芽孢桿菌JN005在防治水稻稻瘟病中的應用。 [0007] 為了實現本發明目的，本發明的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis) JN005是從湖 南省桃江縣大栗港鎮牌形上村（N28° 31' 49. 02"，Ε11Γ 54' 24. 86")感稻瘟病水稻 品種湘早秈24號的病叢中選取健康稻株分離獲得的，采用與稻瘟病菌平板對峙法篩選出 的對稻瘟病菌菌絲抑制率達84%的拮抗菌株，現已保藏于中國典型培養物保藏中心，地址： 中國武漢，武漢大學，郵編430072,保藏編號CCTCC NO !M2015228,保藏日期2015年4月14 曰。
[0008] 菌株JN005在NA培養基平板上培養，對其菌落形態進行觀察及對其菌體的掃描電 鏡圖觀察，菌落形態不規則，邊緣隆起，中間凹陷，粗糙不透明，表面干燥，污白色或微黃色。 JN005菌體呈桿狀，鞭毛周生，無莢膜，大小為（0. 7~0. 8) μ mX (2~3) μ m，芽孢橢圓倒柱 狀位于菌體中央或稍偏，長0. 5~I. 0 μ m，形態如圖1所示。
[0009] 菌株JN005能使淀粉水解、明膠液化，能利用D-果糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、D-甘露 醇，但不能產生H2S,吲哚試驗反應為陰性，不能分解酪蛋白（不產生酪蛋白酶），不能利用 D-阿拉伯糖。
[0010] 菌株 JN005 的 16S rDNA 序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0011] 本發明還提供由所述枯草芽孢桿菌JN005制備的菌劑。
[0012] 本發明還提供所述枯草芽孢桿菌JN005或由其制備的菌劑在防治水稻稻瘟病中 的應用。
[0013] 前述的應用包括將所述枯草芽孢桿菌JN005或由其制備的菌劑施用于水稻作物。 其中，所述菌劑中枯草芽孢桿菌JN005的活菌濃度彡5. 5X 106cfu/mL。
[0014] 本發明進一步提供一種防治水稻稻瘟病的方法，其包括將所述枯草芽孢桿菌 JN005的培養液進行離心，所得上清液施用于水稻作物，或將枯草芽孢桿菌JN005的活體菌 配制菌懸液施用于水稻作物。
[0015] 例如，菌株JN005在NA固體培養基（蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L， 瓊脂17g/L，pH 7. 0,蒸餾水配制）平板上活化后，用打孔器打取直徑5mm的2個菌餅接入 裝有150mL NB液體培養基（蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，pH 7. 0,蒸餾水配 制）的250mL三角瓶中，28°C、180r/min條件下，搖床振蕩培養6d，用細菌過濾器過濾，獲得 枯草芽孢桿菌JN005代謝產物。
[0016] 菌株JN005代謝產物在稻瘟病菌感染前和感染后，以及活體菌（濃度 多5. 5X 106cfu/mL)在稻瘟病菌感染前3-5d，采用噴霧防治法均有較好的防效，表明該菌株 具有良好的保護和治療效果。
[0017] 此外，采用平板對峙培養法發現菌株JN005對多種病原指示菌，例如禾谷鐮 刀菌（Fusarium graminearum)、稻曲病菌（Ustiloginoidea virens)、辣椒炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporioides)生長的抑菌率分別為 70. 1 %、73· 6%和 62. 5%。
[0018] 利用本發明提供的枯草芽孢桿菌JN005對水稻稻瘟病進行防治，避免了化學防治 對環境和稻米安全的潛在不良影響及抗病品種利用的感病化風險。菌株JN005活體菌及其 代謝產物對稻瘟病均有較好的防效，保護和治療作用兼具，可將其作為活體菌劑和代謝產 物的劑型加工開發。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發明枯草芽孢桿菌JN005的菌株掃描電鏡下菌體形態。
[0020] 圖2為本發明實施例1中枯草芽孢桿菌JN005在NA平板上培養結果；其中，A為 菌落形態，B為劃線培養結果。
[0021] 圖3為本發明實施例1中枯草芽孢桿菌JN005對不同病原指示菌的生長抑制效 果；其中，Al為稻曲病菌（Ustiloginoidea virens) ;A2為JN005對稻曲病菌菌絲生長抑 制效果；Bl為禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum) ;B2為JN005對鐮刀菌菌絲生長抑制效 果。
[0022] 圖4為本發明實施例2中枯草芽孢桿菌JN005及其代謝產物對稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)的菌絲生長抑制效果；其中，A為菌株JN005對稻瘟病菌生長抑制效