一種天然水華藍藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定的制作方法
【專利說明】一種天然水華藍藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定
[0001]
技術領域
[0002]本發明屬于生物分析領域，具體涉及一種天然水華藍藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定。
【背景技術】
[0003]微囊藻毒素(microcystins，MCs)是由淡水藍藻中的微囊藻、顫藻及念珠藻等幾類主要的淡水藍藻產生的最常見的毒素。微囊藻毒素的主要結構為環D-丙氨酸-Rl-R2-赤-β-甲基-D-異天冬氨酸-L- Z-adda- D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸，至今已發現80種以上的微囊藻毒素異構體。微囊藻毒素主要是對兩種蛋白磷酸酶(PP-1和PP-2A)的活性，從而產生強烈的肝毒性及誘發癌癥，對哺乳動物具有極大的威脅。在所有淡水藍藻產生的毒素中，微囊藻可能是危害最嚴重的，它常在富營養化的淺湖泊或池塘中大量發生。
[0004]近來隨著人類生活方式的改變，城鎮工業的迅速發展和城市人口的增加，生活污水和部分工業廢水大量注入湖泊致使湖泊漸漸富營養化。水體環境富營養化引起的藍藻水華問題在我國已日趨嚴重，淡水湖泊如滇池、太湖和巢湖，每年夏秋季都會爆發高濃度的藍藻水華，對水體生態系統和人類健康帶來直接或潛在的嚴重危害。物理化學方法治理微囊藻毒素污染耗費大量財力物力，并且治標不治本，甚至還有可能對水體造成二次污染，而微生物去除微囊藻毒素具有成本低、安全性強、利于生態修復等優點，是一種去除微囊藻毒素很有前途的方法。目前，已報道的降解微囊藻毒素純菌株有鞘氨醇單胞菌、銅綠假單胞菌、伯克氏菌等多種鞘氨醇單胞菌屬，但此類菌株對微囊毒素的降低作用十分有限，研宄顯示，采用惡臭假單胞菌降解微囊毒素時，5d后的降解率僅為55.3%。為此，本發明提供一種微囊毒素降解能力更強的菌株，以期為微囊藻毒素的微生物降解提供更好的更高效的方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是解決現有技術中存在的上述問題，提供一種微囊毒素降解能力更強的菌株，且該菌的篩選成本低，可滿足實際大量應用的需求。
[0006]本發明的技術方案如下:
一種天然水華藍藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定，包括以下步驟:
(O制備微囊藻毒素粗品:取天然水華的新鮮藍藻5-10g，置于碾缽中研碎后加提取溶劑，放入磁力攪拌器中攪碎l_2h，離心，取上清液；取濾渣重復萃取3-5次，合并上清液，采用微孔濾膜過濾，將濾液采用PH調節劑調節PH至7.5-8后經0.45um微孔濾膜過濾，在30-60°C條件下蒸發濃縮，再將濃縮液采用0.45um微孔濾膜過濾，制得微囊藻毒素粗品；
(2)采用C18固相萃取柱進行洗脫制備微囊藻毒素純品:將步驟(I)中制得的微囊操毒素粗品，上樣，先用20_50ml蒸飽水洗脫，再用20_50ml 20-35%的甲醇洗脫，最后用40-60ml 40-80%的甲醇洗脫，利用柱層析系統分離、純化，將純化液移至玻璃定量管中，常溫下離心，取上清液旋轉蒸發蒸干溶劑，制得微囊藻毒素產品；
(3)微囊藻毒素的測定:采用微囊藻毒素檢測試劑盒檢測步驟(2)中制備的微囊藻毒素產品，將太湖腐爛的水華上清液添加于基礎培養基中，28-300C恒溫培養，連續富集培養3次，根據菌落性狀不同進行分離純化；
(4)采用基因組提取試劑盒對提取菌株基因組DNA，進行PCR擴增，將所有菌株的16SrRNA基因通過軟件比對，采用最大似然法與最大簡約法構建系統發育樹，并對基因序列采用Blast錄入，觀察該菌株所在分支，判斷篩選菌株與已知菌株親緣關系，并將該菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養基中培養，培養溫度為25-40°C，Ph為7-8，觀察該菌株生理生化特性，根據篩選菌株與已知菌株親緣關系及其生理生化特性對該菌株進行鑒定；
(5)觀察篩選菌株對微囊藻毒素的降解能力:將篩選菌株與惡臭假單胞菌接種至底物為初始濃度為15.4ng/L的M9培養基中，連續5d每24h取樣I次，上清液以微孔濾膜過濾后，測定微囊藻毒素含量。
[0007]優選的，步驟(I)中所述的磁力攪拌的速度為2000-2500r/min。
[0008]優選的，步驟(I)中所述的提取溶劑選自50-80%的甲醇水溶液或酸溶液中的一種或多種。
[0009]優選的，所述的酸溶液選自2-5%的的甲酸溶液、2-5%的乙酸溶液或5-10%的三氯乙酸中的一種或多種。
[0010]優選的，所述的提取液為體積比為(30-40): (60-70)的5%的乙酸溶液與80%的甲醇水溶液。
[0011]優選的，步驟(I)與步驟(2)中所述的離心速度為10000-12000r/min，離心時間為20_30mino
[0012]優選的，步驟(3)中所述的基礎培養基為添加了 l_3mg/L的微囊藻毒素的培養基。
[0013]優選的，步驟(2)中所述的柱層析系統參數為:層析柱直徑2-4cm，長20-40cm，填料為15-20umC18硅膠，流動相為體積比為(30-45): (50-60): (0.03-0.12)的水、甲醇及乙酸；流速為2-5ml/min;進樣體積為2_5ml。
[0014]優選的，步驟(3)中所述的富集培養3次后的培養基中微囊藻毒素濃度依次為5-10 mg/L、10-20 mg/L、20_40 mg/L。
[0015]優選的，步驟(4)中所述的PCR引物采用細菌通用引物，所述的PCR反應條件為:94°C預變性5 m i η，94°C變性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸45 s，38個循環，最后72°C延伸10 m i n , 4°C保存；反應結束后，取5yL反應液經1.2%瓊脂糖電泳，E B染色，紫外檢測。
[0016]所述的PCR擴張時采用的細菌通用引物序列為:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，5’ -ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
[0017]所述的PCR產物由上海生工生物工程技術服務公司完成測序。
[0018]本發明與現有技術相比，有益效果體現在:
1.動物組織中微囊藻毒素的提取溶劑主要包括體積比為1:4的正丁醇及甲醇的的水溶液、酸化的甲醇溶液等，而微囊藻毒素的兩種常見的異構體具有不同的極性，因此，對提取溶劑選擇性也有所不同。本發明中，對提取液的配方及組成成分的體積比均進行了優化，采用體積比為(30-40): (60-70)的5%的乙酸溶液與80%的甲醇水溶液作為提取液時，微囊藻毒素的回收率可達90%以上。
[0019]2.目前，國內外有關微囊藻毒素降解菌的分離等相關研宄中，微囊藻毒素種類、提取方法、菌株接種量及培養基成分等多種原因對篩選菌株的分離等均有不同程度的影響，本發明將篩選菌株與惡臭假單胞菌接種均接種于具有同樣初始濃度的微囊藻毒素的相同培養基中，對相同實驗條件下，兩種菌株對微囊藻毒素的降解能力進行比較，實驗更加嚴謹，結果也更為準確。
[0020]3.本發明中的篩選菌株選自太湖腐爛藍藻，其在常溫甚至高達40°C溫度下，在常規PH范圍內均可良好的生長，具有良好的環境兼容性，因此，將其作為微囊藻毒素的降解菌成本低廉，降解效果好，應用前景十分廣闊。
【具體實施方式】
[0021]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明:
實施例1
一種天然水華藍藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定，包括以下步驟:
(1)制備微囊藻毒素粗品:取天然水華的新鮮藍藻5g，置于碾缽中研碎后加50%的乙醇溶液，放入磁力攪拌器中以2000r/min攪碎lh，以10000r/min離心20min，取上清液；取濾渣重復萃取3次，合并上清液，采用微孔濾膜過濾，將濾液采用PH調節劑調節PH至7.5后經0.45um微孔濾膜過濾，在30°C條件下蒸發濃縮，再將濃縮液采用0.45um微孔濾膜過濾，制得微囊藻毒素粗品；
(2)采用C18固相萃取柱進行洗脫制備微囊藻毒素純品:將步驟(I)中制得的微囊藻毒素粗品，上樣，先用20ml蒸餾水洗脫，再用20ml 20%的甲醇洗脫，最后用40ml 40%的甲醇洗脫，利用柱層析系統分離、純化，將純化液移至玻璃定量管中，以lOOOOr/min常溫下離心15min，取上清液旋轉蒸發蒸干溶劑，制得微囊藻毒素產品；
(3)微囊藻毒素的測定:采用微囊藻毒素檢測試劑盒檢測步驟(2)中制備的微囊藻毒素產品，將太湖腐爛的水華上清液添加于含lmg/L的微囊藻毒素的培養基中，28°C恒溫培養，連續富集培養3次，3次富集后的培養基中的微囊藻毒素的濃度依次為5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L根據菌落性狀不同進行分離純化；
(4)采用基因組提取試劑盒對提取菌株基因組DNA，進行PCR擴增，將所有菌株的16SrRNA基因通過軟件比對，采用最大似然法與最大簡約法構建系統發育樹，并對基因序列采用Blast錄入，觀察該菌株所在分支，判斷篩選菌株與已知菌株親緣關系，并將該菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養基中培養，培養溫度為25°C，Ph為7，觀察該菌株生理生化特性，根據篩選菌株與已知菌株親緣關系及其生理生化特性對該菌株進行鑒定；
(5)觀察篩選菌株對微囊藻毒素的降解能力:將篩選菌株與惡臭假單胞菌接種至底物為初始濃度為15.4ng/L的M9培養基中，連續5d每24h取樣I次，上清液以微孔濾膜過濾后，測定微囊藻毒素含量。
[0022]步驟(2)中所述的柱層析系統參數為:層析柱直徑2cm，長20cm，填料為15umC18娃膠，流動相為體積比為30:50:0.03的水、甲醇及乙酸；流速為2ml/min;進樣體積為2ml。
[0023]優選的，步驟(4)中所述的PCR引物采用細菌通用引物，所述的PCR反應條件為:94°C預變性5 m i η，94°C變性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸45 s，38個循環，最后72°C延伸1min，4 °C保存；反應結束后，取5yL反應液經1.2%瓊脂糖電泳，EB染色，紫外檢測。
[0024]實施例2
一種天然水華藍藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定，包括以下步驟:
(1)制備微囊藻毒素粗品:取天然水華的新鮮藍藻10g，置于碾缽中研碎后加2%的的甲酸溶液，放入磁力攪拌器中以2500r/min攪碎lh，以12000r/min離心30min，取上清液；取濾渣重復萃取5次，合并上清液，采用0.45um微孔濾膜過濾，將濾液采