抗vegf/pigf雙特異性抗體、其制備方法及用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，更具體地，本發明公開了一種能同時與兩種不同靶點 相結合的雙特異性抗體、其制備方法及其在腫瘤治療中的應用。
【背景技術】
[0002] 新生血管生成在腫瘤的發生發展過程中發揮著十分重要的作用。當腫瘤的體積超 過Imm3時，依靠組織滲透所獲得的營養不能夠支撐腫瘤繼續發展對于營養的需求。因此， 腫瘤組織需要通過新生血管的生成來獲取其發展所需要的各種養分。處于缺氧以及營養缺 乏狀態的腫瘤細胞會分泌多種促新生血管生成的因子，如血管內皮生長因子（VEGF)，成纖 維細胞生長因子（FGF)，人胎盤生長因子（PIGF)，腫瘤壞死因子-α (TNF-α)等。在這些 生長因子的作用下，通過一系列復雜的過程，包括血管內皮基質的降解、內皮細胞的遷移、 內皮細胞增殖、管道化分支形成血管環和新的基底膜等步驟來形成新的血管。由于新生血 管生成在腫瘤發生發展中的重要性，通過抑制腫瘤的新生血管生成來抑制腫瘤的生長已經 成為當今腫瘤臨床治療的重要手段。
[0003] 在腫瘤細胞分泌的各種促新生血管生成的生長因子中，VEGF是公認的針對內皮細 胞特異性最高，促血管生長作用最強的有絲分裂原。VEGF與血管內皮細胞上的兩種高親和 力受體VEGFRl和VEGFR2結合后，直接刺激血管內皮細胞增殖，并誘導其遷移和形成管腔樣 結構；同時還可增加微血管通透性，引起血漿蛋白（主要是纖維蛋白原）外滲，并通過誘導間 質產生而促進體內新生血管生成。VEGF在血管發生和形成過程中起著中樞性的調控作用， 是關鍵的新生血管生成刺激因子。
[0004] 目前，Genetech公司開發的針對VEGF的特異性單克隆抗體Bevacizumab (Avastin)在臨床治療中已經取得積極效果，被美國FDA批準其與化療藥物聯合用于轉移 性結腸癌、肺癌以及神經膠質瘤等腫瘤疾病的治療。但是由于腫瘤細胞所分泌的促血管新 生因子的多樣性，以及相關的各種因子在功能上具有一定的可替代性，因此通過抑制單個 促血管新生因子如VEGF的活性并不能完全阻斷腫瘤內的新生血管的生成。臨床前動物實 驗表明，腫瘤組織在經過Bevacizumab處理后，組織內的其他促血管新生因子如PIGF，血管 生成素 _l(angiopoietin_l)，FGF 的表達量顯著上升，（Casanovas 0, Hicklin DJ, Bergers G，Hanahan D. Drug resistance by evasion of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors. Cancer Cell2005;8:299-309. )〇 此外，臨床試驗也進'一*步證明，在結腸癌患者中，經過抗VEGF的治療后，患者體內的PIGF 水平顯著升高（Willett CG，Boucher Y，Duda DG，di Tomaso E，Munn LL，et al. Surrogate markers for antiangiogenic therapy and dose-limiting toxicities for bevacizumab with radiation and chemotherapy: continued experience of phase I trial in rectal cancer patients. J Clin 0ncol2005;23:8136_9)。
[0005] 與VEGF不同的是，PIGF選擇性地與VEGFRl以及它的輔助受體神經氈蛋 白-l(neuropilin-l)和神經毯蛋白-2 (neuropilin-2)相結合，并且在巨嗤細胞、骨髓 前體細胞的表面表達大量的VEGFR1。功能上，PIGF除了能夠刺激內皮細胞的增殖、遷移 外，還能夠通過趨化作用招募巨噬細胞和髓系前體細胞進入腫瘤組織，在腫瘤組織內形成 一個有利于血管新生的微環境。依賴PIGF所招募的巨噬細胞以及相關髓系細胞在腫瘤 組織新生血管生成的過程中發揮了重要的作用。研究表明，侵潤進入腫瘤組織的巨噬細 胞在相關微環境中被誘導成M2型巨噬細胞。與Ml型巨噬細胞主要起激活機體特異性免 疫應答的作用不同，M2型巨噬細胞能夠大量合成和釋放各種抗炎細胞因子如白介素-10 (IL-10)、腫瘤生長因子-β (TGF-β )等、免疫抑制因子以及多種促進腫瘤生長的細胞因 子，從而抑制炎癥反應和促進腫瘤細胞生長與轉移。通過氯膦酸鹽脂質體（clodronate liposomes)或抗PIGF抗體去除侵潤腫瘤組織的巨噬細胞后，組織內的血管新生和腫瘤的 生長被顯著抑制。此外，臨床前動物體內實驗證明，在對抗VEGF抗體耐受的移植瘤模型中， 抗PIGF抗體和抗VEGF抗體聯用能夠顯著增強抗VEGF抗體的體內抗腫瘤作用（Fischer Cj Jonckx Bj Mazzone M，Zacchigna Sj Loges S，et al.Anti-PIGF inhibits growth of VEGF(R)-inhibitor-resistant tumors without affecting healthy vessels. Cell2007; 131:463-75)。但是在臨床實踐中，一方面，由于聯合應用兩種抗體造價太高，且 可用于組合治療的抗體數目有限，另一方面，臨床上兩種不同靶向抗體藥物進行聯合治療 在安全性方面存在著諸多風險。
[0006] 因此，構建一個能夠同時與VEGF和PIGF相結合的雙特異性抗體，進而更有效地抑 制腫瘤生長，一直是本領域的技術人員急待解決的問題。
【發明內容】
[0007] 為了解決上述問題，本發明的發明人進行了大量試驗，得到了一個可以同時阻斷 VEGF和PIGF兩個靶點的雙特異性抗體，即本發明所述的"重組抗VEGF/PIGF雙特異性抗 體"，從而完成了本發明。
[0008] 具體地，本發明公開了：
[0009] 1、一種抗VEGF/PIGF雙特異性抗體，其特征在于，所述抗體既能與VEGF結合，又能 與PIGF相結合。
[0010] 2、上述1所述抗VEGF/PIGF雙特異性抗體，其特征在于，所述雙特異性抗體氨基酸 序列包含抗VEGF單克隆抗體的可變區和抗PIGF單克隆抗體的可變區序列。
[0011] 3、上述1或2所述抗VEGF/PIGF雙特異性抗體，其特征在于，所述雙特異性抗體輕 鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:8所示，所述雙特異性抗體重鏈可變區 氨基酸序列為SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12所示。優選地，
[0012] 所述雙特異性抗體還包括恒定區，且其輕鏈恒定區氨基酸序列為SEQ ID NO:2所 示，重鏈恒定區氨基酸序列為SEQ ID N0:4所示。
[0013] 4、一種分離的核酸分子，其編碼上述1-3任一所述的抗VEGF/PIGF雙特異性抗體。 優選地，所述核酸分子編碼所述雙特異性抗體輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO: 7所示，編碼所述雙特異性抗體重鏈可變區的核苷酸序列為SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 11 所示。
[0014] 5、一種表達載體，含有上述4所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相 連的表達調控序列；優選的，其所述載體可以為pCHOl. 0、pDRl、pcDNA3. 1 ( + )、pcDNA3. 1/ ZEO(+)或 pDHFR。
[0015] 6. -種宿主細胞，含有上述5所述的載體。優選的，所述宿主細胞為真核細胞。優 選的，所述宿主細胞為哺乳動物細胞。最優選的，所述宿主細胞為CHO細胞。7、一種制備上 述1-3任一所述的抗VEGF/PIGF雙特異性抗體的方法，所述方法包括步驟：
[0016] a)在表達條件下，培養上述6所述的宿主細胞，從而表達抗VEGF/PIGF雙特異性抗 體，
[0017] b)分離或純化所述的抗VEGF/PIGF雙特異性抗體。
[0018] 8、一種組合物，含有上述1-3任一所述的抗體和藥學上可接受的載體。
[0019] 9、上述1-3任一所述的抗VEGF/PIGF雙特異性抗體或上述8所述的組合物在制備 抗腫瘤藥物中的用途。
[0020] 10、上述9所述用途，還包括和其他的抗腫瘤藥物聯合使用。
[0021] 本發明中，任何能夠同時和VEGF，P