低豐度差異蛋白的分離方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于蛋白檢測技術領域，具體涉及一種低豐度差異蛋白的分離方法及其應 用。
【背景技術】
[0002] 經過對所有疾病潛伏和發病過程的研宄已經證實，潛在的疾病或潛伏期的生理狀 態都已經找到了很好的和生理狀態相關的生物標記分子，這些生物標記分子，大多是豐度 較低的蛋白。這些低豐度蛋白在血漿中，都只有很低的濃度，且經常會被白蛋白等高豐度蛋 白，致使在疾病潛伏的前期檢測中難以被檢測出，大大延遲了疾病的發現時間。所以，差異 性的比較正常及非正常生理狀態下的血漿蛋白，并找出相應的生物標記分子，從而輔助疾 病的更早發現具有重要的醫學意義。
[0003] 然而基于上述目的，要差異性的比較正常及非正常生理狀態下的血漿蛋白，并找 出相應的生物標記分子，采用目前蛋白質組學的常規檢測手段，存在著比較大的困難。原因 在于尋找生物標記蛋白的過程中，要先消除高豐度蛋白對整個系統的掩蓋，使很低濃度的 蛋白可以被檢測到。目前通常的方法是將所有的蛋白顯示在2D電泳膠上，然后對比不同樣 本之間的差異蛋白；而其中，首先2D電泳并不能顯示出極度酸性或者堿性的蛋白，以及疏 水性較大的脂蛋白；如果蛋白質過多，蛋白斑點的識別也存在著較大的困難；其次血漿中 的高豐度蛋白會掩蓋真正具有很重要生物活性作用的微量蛋白，雖然已經有報導各種親和 方法如CB染料介質、抗體介質等來去除高豐度蛋白，但能去除的蛋白還是很有限，并不能 去除大部分house-keeping蛋白和正常功能蛋白；第三，和非正常生理狀態相關的生物標 記蛋白并不局限于低豐度蛋白，有些豐度較高的蛋白也在疾病報道中出現，因此所以僅僅 使用高豐度去除也會導致結果不準確。
[0004] 基于上述不足，本案的發明人早先于2010年在CN102430176A號專利中提出了一 種對待測蛋白和對照蛋白之間的差異蛋白進行富集，從而提升待測蛋白或者多肽濃度的方 法。其技術實現的過程采用將標準對照蛋白作為抗原進行免疫，制備得到能夠與該對照樣 品中的至少一種蛋白或多肽結合的免疫球蛋白（其實就是以標準對照蛋白作為抗原產生 的一抗抗體，屬于多克隆抗體），然后用該免疫球蛋白制成親和介質的層析柱，用來吸附待 測樣品中的大量高豐度蛋白，從而流穿組分即為富集濃縮的待測蛋白中的低豐度差異蛋 白。
[0005] 但是這一早先的做法中，采用正常對照蛋白通過免疫制備得到抗體，對照蛋白本 身采用的是正常蛋白，所分離和濃縮得到的低豐度蛋白只是新出現或上調的潛在標志蛋 白，而無法進一步直接確定這些蛋白的表達是屬于非正常血漿中的下調蛋白或者是正常血 漿中含量較多的上調蛋白，需要進一步的在采用對比進行大量的對比檢測，增加繁復步驟 之后降低了準確性，提升了工作量，使得上述方法實施中存在不足。
【發明內容】
[0006] 本發明實施的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種能夠直接分離富集非 正常血漿中的低豐度下調蛋白的低豐度差異蛋白的分離方法及其應用。
[0007] 為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下：
[0008] -種低豐度差異蛋白的分離方法，包括如下步驟：
[0009] 獲取健康對照組蛋白樣品和患者對照組蛋白樣品和待測組蛋白樣品；
[0010] 將健康對照組蛋白樣品作為抗原進行免疫，制備高豐度蛋白多抗；并以所述高豐 度蛋白多抗為親和配體與固相基質制備高豐度親和層析柱；
[0011] 將患者對照組蛋白樣品于所述高豐度親和層析柱進行過柱，并收集流穿組份；
[0012] 將所述流穿組分濃縮后作為抗原進行免疫，制備低豐度蛋白多抗；并以所述低豐 度蛋白多抗作為親和配體固定與固相基質制備低豐度親和層析柱；
[0013] 將待測組蛋白樣品于所述低豐度親和層析柱進行過柱，并收集洗脫組分。
[0014] 本發明在上述低豐度差異蛋白的分離方法的基礎上，還提出一種上述低豐度差異 蛋白的分離方法在低豐度差異表達蛋白檢測上的應用。
[0015] 本發明的低豐度差異蛋白的分離方法和應用，在原先方法的基礎上，先用健康組 的蛋白進行一次免疫，制備能用來濾除大量背景高豐度差異蛋白的高豐度多抗，然后用該 高豐度蛋白多抗制備高豐度蛋白層析柱去除非正常患者差異表達蛋白樣品中的背景高豐 度蛋白，收集的流穿組分即為非正常患者差異表達的低豐度蛋白；然后將該流穿組分濃縮 之后作為抗原去進行第二次免疫，得到低豐度差異表達的多抗，之后再用該低豐度差異表 達的多抗作為配體進一步制備低豐度差異蛋白的層析柱，便可以直接一次分離待測組蛋白 樣品中屬于非正常血漿中的下調蛋白或者是屬于正常血漿中含量較多的上調蛋白。整體過 程可以一次直接分離得到正常血漿中含量較多的上調蛋白，降低了分離過程的繁復性，提 升了分離和檢測效率，而且最后的洗脫組分直接針對差異表達的低豐度蛋白，具有更高的 特異性和針對性。
【附圖說明】
[0016] 下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中：
[0017] 圖1為本發明實施例分別采用正常人血漿和另一名肝癌患者血漿分別作為待測 蛋白按照上述步驟檢測獲得的洗脫液進行SDS-PAGE電泳銀染的圖片。
【具體實施方式】
[0018] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并 不用于限定本發明。
[0019] 本發明實例提出一種低豐度差異蛋白的分離方法，包括步驟概括如下：
[0020] S10,獲取健康對照組蛋白樣品、患者對照組蛋白樣品和待測組蛋白樣品；
[0021] S20,將健康對照組蛋白樣品作為抗原進行第一次免疫，制備高豐度蛋白多抗；
[0022] S30,將步驟S20獲得的高豐度蛋白多抗作為親和配體，固定至層析柱的固相載體 上，制備高豐度親和層析柱；
[0023] S40,將患者對照組蛋白樣品用步驟S30制備的高豐度親和層析柱進行過柱，收集 流穿液；
[0024] S50,將步驟S40收集的流穿液進行濃縮之后，作為抗原進行再次免疫，制備低豐 度蛋白多抗；
[0025] S60,將步驟S50獲得的低豐度蛋白多抗作為親和配體，固定至層析柱的固相載體 上，制備低豐度親和層析柱；
[0026] S70,將待測組蛋白樣品于步驟S60所制備的所述低豐度親和層析柱進行過柱，并 收集洗脫組分。
[0027] 本發明的低豐度差異蛋白的分離方法，在原先方法的基礎上，先用健康組的蛋白 進行一次免疫，制備能用來濾除大量背景高豐度差異蛋白的高豐度多抗，然后用該高豐度 蛋白多抗制備高豐度蛋白層析柱去除非正常患者差異表達蛋白樣品中的背景高豐度蛋白， 收集的流穿組分即為非正常患者差異表達的低豐度蛋白；然后將該流穿組分濃縮之后作為 抗原去進行第二次免疫，得到低豐度差異表達蛋白的多抗，之后用該低豐度差異表達蛋白 的多抗作為配體進一步制備低豐度差異蛋白的層