致，在選擇之前隨機積累突變。A (lambda)參數是1. 325,假定突變率為2. 1610-05， 從最近共同祖先的估計時間是22天（95% CI，18-27)。考慮到該置信區間的上限是27天， 很有可能該樣品在感染4周內被獲取，因此，該取樣時間稱為"第四周"，作為保守估計。該 時間估計進一步被登記時的Feibig分期支持。到第14周（圖7B)，樹不再與星形系統發育 或泊松分布（P〈〈10-10) -致，表明選擇在很好地進行中。注意，盡管在第4周的突變數據 (圖7A)與泊松分布在統計學上一致，觀察到的成對序列一致性的數目相對于預期有所降 低了，觀察到的漢明距離1和2的數目比預期稍多。這很重要，因為該偏移是在CH103接觸 殘基中在D環中單個突變（N279K)的結果一一因此，盡管從泊松的偏移并不顯著，考慮到其 位置，有可能該位點是選擇的非常早期的標志。（Giorgi et al, BMC Bioinformatics Oct 25 ;11:532(2010)，PMID:20973976http://www. hiv. lanl. gov/content/sequence/POISSON FITTER/poisson fitter, html)
[0018] 圖8。〇1505病人的血漿抗體隨時間結合至自身傳播/首建（T/F)和異源HIV-lEnv 蛋白。血漿樣品從HIV-1病人CH505縱向收集（從感染的時間開始（x軸中）），并基于 TZM-bl細胞的中和測驗，對針對抗自身傳播/首建（T/F)病毒和異源HIV-lEnv假病毒的中 和活性進行測試，所述異源HIV-lEnv假病毒包括亞型B (B) SF162、JRFL和BG1168)和亞型 A。結果以IC50表示（相互血漿稀釋）（在y軸中）。
[0019] 圖9A和9B。CH103克隆性世系中的抗體對HIV-lEnv重新在表面的核心3 (RSC3) 和RSC3突變體的反應性。CH103克隆性世系中的抗體以100微克至0. 0005微克/毫升范 圍的劑量在ELISA中測試對于（圖9A)HIV-lEnv RSC)和（圖9B)具有P363N和D371I突 變的RSC3的結合。結果以EC50 (微克/毫升）表達，并在個體抗體旁邊表示。NB =沒有可 檢測到的結合。
[0020] 圖 10A 和 10B。重組 HIV-lEnv gpl40 和 gpl20 蛋白 * 的 SDS-PAGE 分析。HIV-lEnv gpl20和gpl40蛋白在還原性條件下在SDS-PAGE上分析（圖10A)，gpl40蛋白在藍色陰 性PAGE上分析（圖10B)。在膠的上部鑒定出單獨的HIV-lEnv蛋白。圖10A，在SDS-PAGE 中，在本研宄中使用的HIV-lgpl20和gpl40在還原性條件下沒有降解。圖10B，大部分異 源HIV-lEnv gpl40Env和所有自身CH505gpl40Env主要以三聚體迀移，并也含二聚體和單 體形式。
[0021] 圖11A-11D。通過HEp-2染色、ANA測驗和蛋白陣列微芯片分析對CH103克隆性世 系抗體的多反應性進行的分析。CH103克隆性世系中抗體的反應性通過間接免疫熒光染色 (圖11A)和ANA測驗（圖11B)來測試。對于單個抗體的免疫熒光染色的*200倍放大的圖 呈現在抗體ID旁邊。顯示了使用成組的自體同源抗原通過ANA分析單個抗體的反應性的 結果（圖11B)。中間抗體（I1)和CH106用HEp-2細胞被鑒定為具有反應性，然后被選擇用 于進一步的使用Invitrogen ProtoArrays?，用人類宿主細胞抗原對活性的測試（圖11C和 11D)。發現II (圖11C)和CH106(圖11D)表現出特異性的自身反應性和很強的多反應性。 通過免疫焚光檢驗法確定結合的抗體，對于151K陣列上9400個重組人類蛋白的相對焚光 強度（y軸）對IA1 (圖11C)和CH106(圖11D)陣列中的同源性強度（x軸）作圖。所有蛋 白在每個陣列上印2份重復副本，并且每個數據點代表一個熒光測量值。每幅圖中的對角 線通過II、CH106和151K對照抗體的相等的熒光強度（等效結合）。被II和CH106結合 的自身抗原通過相比于151K的高熒光強度來鑒定，并用圓圈表示。多反應性通過顯著的并 且普遍從對角線偏移來表示。鑒定出的自身抗原：BHMT2(甜菜堿-同型半胱氨酸甲基轉移 酶2) ;CENP-R(著絲粒蛋白R)【151K】；eEF-2K(真核延長因子2激酶）；UBE3A(泛素-蛋 白連接酶E3A)【IA1和CH106】 ;TGM2 (谷氨酰胺轉移酶2)【CH106】 ;NFKBIA (B細胞抑制劑 a中k輕多肽基因增強子的細胞核因子）；FAM184A (具有序列相似性184的家族，成員A) 【II】。
[0022] 圖12A和12B。在P21空間群中CH103_gpl20復合體的晶體堆積。圖12A，晶體 晶格的視圖。在每個非對稱單元中的兩個復合體被標為紅色和藍色虛線，并在卡通圖中顯 示，其中gpl20為紅色和淺橙色，CH103重鏈為綠色和淺綠色，CH103輕鏈為淺藍色和藍綠 色。圖12B，在兩個相鄰的復合體之間的晶格的放大視圖。當來自VRC01復合體的進化枝C ZM176. 66的延伸的核心gpl20疊加在其在CH103復合體中有序的相應部分時，以洋紅色顯 示的內部結構域與相鄰復合體抵觸，表明gpl20的內部結構域并不存在于CH103-gpl20晶 體中，因為在晶體生長期間的蛋白水解降解。
[0023] 圖13。在CH505中，HIV隨時間進化的像素圖和系統發育樹。像素工具(http:// www. hiv. lanl. gov/content/sequence/pixel/pixel. htmn)被用來顯不包膜的 VI 至 V5 區 域中的氨基變化；焦點在此區域，由于其最關鍵的CD4bs抗體易感性，并包括所有已知的 ⑶4結合接觸，其表示為沿著圖的頂部的黑色抖動（tic)標記。藍色tic標記表示CH103 接觸殘基，水平的藍線表示gpl20的用于CH103晶體結構的部分（盡管接觸表面大部分在 該處，但是還缺失了對于⑶4和VRC01重要的一部分，這就是我們使用⑶4接觸來幫助限定 在那些缺失的區域中可能對CH103結合重要的部分的原因）。每行是序列，并且其被根據 系統發育排序。紅色部分表示相對于TF病毒的氨基酸改變，黑色部分表示插入或缺失。對 翻譯的Env序列用PhyML. v2[l]和JTT替代模型[2]來構建右邊的系統發育樹。該樹被 設置為梯狀，T/F病毒從傳播4周后獲得的第一時間點的序列重建。顏色表示感染后的估 計周數。該樹用APE v3. 0-6 [3]提出，兩者都用R v2. 15. 1 [4]。箭頭表示第30-53周的選 擇性瓶頸。（Guindon et al，Syst. Biol. 52:696-704(2003)，Jones et al，Comput Applic Biosci 8:275-282 (1992), Paradis et al, Bioinformatics 20:289-290 (2004), R Core Team. 2012. R:A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www. R-proiect. org/〇 )
[0024] 圖14。熵圖，其顯示在CH505中在每個取樣的時間點中的每個位點多樣性。顯示了 全長gpl60,突出顯示了⑶4和CH103接觸殘基。本圖顯示了在比對中每個位置的香農熵， 其中考慮了位置字符的所有觀察到的頻率，并且缺口以字符處理（Korber J Virol. 1994; 68(11) :7467-81)。這提供了橫跨Env的區域性的時間點內多樣性的圖，并顯示了隨著時間 流逝突變集中的地方和關鍵區域的相對多樣性。
[0025] 圖15A和15B。在與CH103表位相關的區域，在CH505中與在其他主體中病毒序 列進化的速度的比較。圖15A，序列距離的分布表示為在兩個序列之間不同的氨基酸的百 分比，這是由在給定時間點取樣的所有序列匹配比較得到的。存在所有同源感染的情況，因 此，在急性感染中，在CH103相關區域的突變少到幾乎沒有，或者在病毒（左手邊組）中的 其他地方。在登記24周后（從在CH505中感染第30周，在此標記為第六個月，因為這是大 約的），開始產生大量突變，其集中于CH103相關區域（上面中間組），但是不在Env的其他 區域（下面中間組）。在該時間框中取樣的15個主體中，CH103具有最高排名的多樣性（p =0. 067)，表明在該主體中開始得異常早的集中的選擇性壓力。過一年（第12月表示從登 記的10-14個月取得的樣品），該區域開始在許多個體中進化，可能是由于在感染后期開始 的自身NAb反應。圖15B，基于CH103相關區域的系統發育樹。在該視圖中，以金色顯示的第 6個月偏離T/F病毒的大量進化尤其突出。在第6個月，在CH505中取樣的序列和T/F祖先 狀態取樣的序列之間的距離比在第二最多變的個體704010042中的序列多得多（Wilcoxon 秩和，p = 0? 0003: CH505,中位數=0? 064,范圍=0? 019-0. 13, N = 25, 704010042,中位數 =0? 027,范圍=0? 009-0. 056, N = 26)。
[0026] 圖16。病毒和抗體的共同進化--抗體CH103的成熟和gpl20中序列可變性表位 之間的相互作用。每個時間點的序列可變性（在樣品中）繪制于gpl20結構中，其追蹤從傳 播后14周至100周的時間內的病毒進化。每個殘基的熵用顏色編碼綠色到白色到紅色，以 表示沒有序列變異至輕微變異至高度序列變異。該廣泛的病毒時間點內的多樣性與最終發 展寬度的正在成熟化抗體系相一致。在此，體細胞突變隨著CH103克隆系從未突變的共同 祖先（UCA)至1-8至1-4至1-3至1-2至1-1并至成熟CH103捕獲。抗體的重鏈（紫色） 和輕鏈（藍綠色）的著色球表示根據下面方案的進化途徑期間體細胞突變的出現/消失。 紅色球：在1-8出現并一直保持直到成熟成CH103的突變，橙色球：在1-4出現并一直保持 直到成熟成CH103的突變，藍色球：很早出現但在成熟成CH103前消失的突變，灰色球：在 成熟中非常晚期出現的突變。在本工作中確定的來自ZM176. 66復合體的Fab CH103-gpl20 的結構被用于對這些突變作圖。在100周的序列熵被用于與CH103匹配，以簡單地表示體 細胞突變的相對空間位置和gpl20中序列可變性。如在本文中討論的，病毒隨時間進化追 隨中和寬度，該簡單的作圖支持（i)T/F病毒開始在表位的區域中或鄰近表位的區域中非 常早期地進行多樣化，和（ii)在進化早期產生并在重鏈中保持固定的體細胞突變傾向于 在gpl20接觸區域聚集，這不同于后期出現的那些突變。
[0027] 圖17A和17B。氨基酸（圖17A)和核酸（圖17B)序列。703010505. TF是傳播/ 首建序列，"W和數量"表示傳播后的周數。
[0028] 圖18。在BnAb誘導之后急性感染病人中抗體-病毒的共同進化。
[0029]圖 19A-19D。多價疫苗序列。CH505Env 序列（圖 19A 和 19B)，CH505_D8gpl20 序 列（圖19C)和相應的切割位點突變（圖19D)(突出顯示的）。
[0030] 圖20。HIV-1軍備競賽：來自于慢性感染的病人CH0505的從傳播的時間之后的廣 泛中和抗體的分離。
[0031] 圖21。圖20中顯示CH0505的相同病毒克隆系樹--右側加星形的是為免疫原選 擇的順序env的例子，在左邊的樹上加星形的是圖17中的env序列。
[0032] 圖22。CD4、VRC01和bl2的接觸區域，以及影響VRC01和bl2中和的bl2和標識 位點在CH0505中受到很大的選擇性壓力。
[0033] 圖23。在僅僅⑶4/bl2/VRC01接觸殘基中的成對區別的數目對于CH0505也相對 尚。
[0034] 圖24。來自CH0505的克隆103的克隆系樹--與CH0505傳播/首建Env gpl40 (EC50微克/毫升）結合。
[0035] 圖25。來自CH0505的克隆CH103的克隆系樹--等級2CH0505 (EC50,微克/毫 升）的中和。
[0036] 圖26。HIV-1疫苗設計。
[0037] 圖27。在HIV-1感染的個體（CH505)中的BnAb發展期間的病毒進化。
[0038] 圖 28。CH505Env gpl20 與 RSC3 的比對。
[0039] 圖29。對于CH505外部結構域免疫原的設計。
[0040] 圖30。通過CH505Env變異體單獨或者順序施用于BALB/c小鼠誘導的RSC3比 RSC3 A 371蛋白的血漿結合比例。
【具體實施方式】
[0041] 在下列實施例中描述的本研宄的結果表明T/F Env結合至BnAb世系的UCA B細 胞受體導致廣譜的中和抗體的誘導，以此來提供疫苗誘導的CD4bs BnAb克隆性活化和擴增 的邏輯起始位置。重要的是，實現中和寬度所需的突變數量相比于大多數CD4bs BnAbs來 說在CH103系中減少，盡管CH103系相比于突變較多的⑶4bs BnAbs來說中和寬度降低。 通過早期感染追蹤病毒進化發現，在該個體中，在獲得NAb寬度之前，T/F病毒中發生強度 選擇和表位多樣化一一由此表明病毒變異體或變異聯合體與直接來自于自體同源性中和 抗體的BnAb的發生相關，并說明了用于誘導類似B細胞系的通路。（參見圖17A、B和圖 19A-D中病毒包膜序列（和編碼序列）。）用作免疫原的包膜可以全長gpl40、具有跨膜部 分的gpl45、gpl20s、重新暴露的于表面于表面核心蛋白gpl20、外部結構域構造體gpl20， 或者具有CH103接觸部分（例如gpl20D環、V5環和表達的CD4結合位點環區域）的其他最 小gpl20構造體的形式表達，以使得UCA和/或中間抗體和/或成熟的CH103、CH104、CH105 和CH106成熟抗體與免疫原構造體結合。
[0042] 根據本發明，免疫方法可包括選自圖17和19的Env構造體的順序免疫，或者可涉 及Env聯合體的初級和加強免疫，或者施用該序列的"群"（例如圖19A-D中的序列）。也 可使用免疫原片段/亞基，因為可以編碼核苷酸序列。或者，在病人中傳播CH505之后，可 傳播的首建病毒Env構建體可用作初免，然后再用該可傳播的首建Env來加強免疫，并在后 續次數漸進地順序加入額外的Env。進一步的，重復免疫可能被CH505Env的"群"影響（例 如，包括圖19A-D中的蛋白質和核酸序列的多種組合），其范圍為例如2-40個Env。本發明 的免疫接種策略的例子在圖18中表示。
[0043] 在下列實施例中提供的數據對于理解CH103世系的B細胞成熟通路，以及對于在 免疫接種條件下重復類似的通路具有暗示。首先，證明了在CH505中BnAbs由順序Env進 化驅動，其最早起始于傳播后的14周，假設是正確的免疫原，與使用疫苗的BnAb世系的這 種類型的誘導相容的時間段。第二，雖然異源Env并不結合UCA或者該世系的早期中間抗 體，但是CH505T/F Env與CH103UCA非常棒地結合，并且隨后的Env與后的續克隆性世系成 員以增加的親和性結合。因此，用Env或Env亞基的類似序列的免疫可以預期為驅動類似 的世系。第三，CH103世系相比于VRC01類抗體并不復雜，因為在該世系中的抗體具有較少 的體細胞突變，并且沒有插入缺失標記，除了 CH103'在LCDR1區域有一個3個氨基酸殘基 的缺失外。下面實施例1中描述的研宄是在一個病人中進行的。但是，在每一個BnAb病人 中，病毒進化的分析應該闡明誘導BnAb寬度的進化的Env的類似的通路。感染了 CCR5-熱 帶SHIV-AD8病毒的恒河猴頻繁地發展出中和寬度（Shingai et al，Proc?Natl?Acad?Sci? USA 109:19769-19774(2012)) 的觀察表明某些包膜可能比其他包膜更有可能誘導寬度和 強度。
[0044] 在外緣的親和力成熟期間，在CH103世系中產生的對于在宿主分子的多反應性與 與BnAb活性相一致。該發現與下列假設相一致：BnAbs可能源自于B細胞的內在性多反應 性池（其具有多反應性，這通過Env和宿主分子的異源連接提供了中和優勢）（ouquet et al, Nature 467:591-595(2010)，Alam et al，J. Immunol. 178:4424-4435(2007))。
[0045] 或者，由于CH103親和力成熟涉及適應多樣的共循環形式的表位的同時存在 (Malherbe et al，J. Virol. . 85:5262-5274 (2011))，選擇能夠與大量逃逸株產生的表位多 樣性相互作用的抗體可能還是驅動多反應性的易獲得的進化動力。
[0046] 因此，在一個實施方式中，本發明涉及一種在主體（例如人）中激活適宜的初始B 細胞反應的方法，所述方法通過施用CH505T/F Env或Env亞基（其可包括具有跨膜部分的 gpl45、gp41和gpl20、未剪切的gpl40、剪切的gpl40、gpl20、gpl20亞基，例如重新暴露的 于表面的核心（Wu X，Science 329:856-61 (2010))、外部結構域、或者僅表達CH103與Env 的接觸點的最小表位，即gpl20D環、V5環和CD4結合位點環區域（最小表位，以避免顯性 Env非中和表位）），然后用隨后進化的