一種雜色蛤物種實時熒光pcr特異性檢測體系及應用
【專利說明】-種雜色蛤物種實時熒光PCR特異性檢測體系及應用
[0001]
技術領域
[0002] 本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種雜色蛤物種實時熒光PCR特異性檢測體 系及應用。
【背景技術】
[0003] 雜色蛤是貝殼類海產品，隸屬簾蛤科，學名菲律賓蛤仔，南方俗稱花蛤，遼寧稱蜆 子，山東稱蛤蜊。雜色蛤廣泛分布在我國南北海區，它生長迅速，養殖周期短，適應性強(廣 溫、廣鹽、廣分布)，離水存活時間長，是一種適合于人工高密度養殖的優良貝類，是我國主 要海產經濟貝類之一。通過形態學特征進行判斷是對雜色蛤識別的傳統方法，但是這些形 態學特征的可塑性強，受環境影響大，具有人為的主觀傾向性，且存在豐富的近緣物種，近 緣種間的形態差異細微，所以傳統的形態學特征識別方法存在識別困難與識別錯誤的問 題。
[0004] 快速進化并呈母系遺傳的線粒體DNA是種群遺傳學和進化遺傳學的理想研宄對 象。雜色蛤與其它近源物種的序列相似度在85-94%之間，而CoxI基因序列有較大差異， 目前，貝類動物的分子檢測主要集中于這一序列。采用DNA技術鑒定動物物種是物種識別 方法中最為熱門也是發展最快的分子技術。實時熒光PCR是DNA技術鑒定中快捷高效的技 術之一，指在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR)循環后產物總 量的方法，研宄利用實時熒光PCR對雜色蛤進行物種識別對雜色蛤的物種保護及系統發育 研宄等領域均具有重大意義。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是克服上述不足問題，提供一種雜色蛤物種特異性檢測體系及該特 異性檢測體系的應用方法。本發明可以檢測出來自動物樣品的微量DNA，完全區分雜色蛤的 基因與其它貝類動物基因，檢測靈敏度高，方法快速，易操作。
[0006] 本發明為實現上述目的所采用的技術方案是：一種雜色蛤物種實時熒光PCR特異 性檢測體系，其特征在于：包括引物與探針的序列是： 上游引物：5' -ggttgaacagtctaccctcc-3' ； 下游引物：5' -gctaacatactactacgcaaaa_3' ； 探針：5> -tctcttcacgtaggtggtgtctcttcaatt_3,〇
[0007] 進一步地，所述探針的5'端標記FAM熒光基團，3'端標記熒光淬滅基團。
[0008] 進一步地，所述雜色蛤物種實時熒光PCR特異性檢測體系還包括由其他試劑所組 成的反應體系如下表1 : 表1雜色蛤物種實時熒光PCR特異性檢測體系的反應體系
[0009] 進一步地，所述雜色蛤物種實時熒光PCR特異性檢測體系的反應參數如下表2 : 表2雜色蛤物種實時熒光PCR特異性檢測體系的反應參數
[0010] 一種根據所述的雜色蛤物種實時熒光PCR特異性檢測體系的應用，其特征在于： 利用所述雜色蛤物種實時熒光PCR特異性檢測體系對雜色蛤物種進行實時熒光PCR特異性 檢測。
[0011] 進一步地，所述雜色蛤物種進行實時熒光PCR特異性檢測方法為：采用雜色蛤 物種實時熒光PCR特異性檢測組合物進行實時熒光PCR擴增雜色蛤的CoxI基因，以 HotstartTaqDNA聚合酶進行PCR反應，當DNA鏈延伸到雜色蛤物種特異性檢測探針位置 時，以HotstartTaqDNA聚合酶的5'端外切酶活性切斷雜色蛤物種特異性檢測探針的淬 滅基團，使雜色蛤物種特異性檢測探針發出熒光信號，經信號收集處理，獲得特異性擴增曲 線。
[0012] 本發明特異性引物設計合理，用于雜色蛤物種檢測，特異性好，檢測靈敏度高。采 用本方法檢測雜色蛤動物成分結果顯示，采用雜色蛤物種特異性檢測引物與探針進行實時 熒光PCR擴增雜色蛤的CoxI基因，會產生一條特異性擴增曲線，即經過實時熒光PCR分 析，即可將雜色蛤成分進行準確鑒定，具有很好的特異性。
【附圖說明】
[0013] 圖1為5種引物PCR結果圖，圖中：M、DL2000marker;1、P1P2引物擴增結果，2、P3P4 引物擴增結果，3、P5P6引物擴增結果，4、P7P8引物擴增結果，5、P9P10引物擴增結果，6、陰 性對照，7、空白對照。
[0014] 圖2為雜色蛤實時熒光PCR特異性檢測結果圖，圖中：1、雜色蛤，2、雜色蛤，3、陰性 對照，4、空白對照。 圖3為雜色蛤與其他海洋動物的實時熒光PCR特異性檢測結果圖，圖中：1、雜色蛤， 2、雜色蛤，3、雜色蛤，4、夏夷扇貝，5、紫海膽，6、太平洋牡蠣，7、魁蚶，8、陰性對照，9、空白對 照。
[0015] 圖4為靈敏度分析結果圖，圖中：1、5ng/yL擴增結果；2、lng/yL擴增結果；3、 0. 5ng/yL擴增結果；4、0.lng/yL擴增結果；5、0. 05ng/yL擴增結果；6、陰性對照；7、空 白對照。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合附圖和實施例對本發明進行詳細說明，但本發明并不局限于具體實施 例。
[0017] 本實施例中所利用的雜色蛤物種實時熒光PCR特異性檢測體系包括引物與探針 的序列是： 5' -ggttgaacagtctaccctcc-3'（上游）； 5' -gctaacatactactacgcaaaa-3'（下游）； 5' -tctcttcacgtaggtggtgtctcttcaatt-3'（探針）。
[0018] 所述雜色蛤物種實時熒光PCR特異性檢測體系還包括由其他試劑所組成的反應 體系如下表3 : 表3雜色蛤物種實時熒光PCR特異性檢測體系的反應體系
[0019] 所述雜色蛤物種實時熒光PCR特異性檢測體系的反應參數如下表4 : 表4雜色蛤物種實時熒光PCR特異性檢測體系的反應參數
[0020] 一種所述雜色蛤物種實時熒光PCR特異性檢測體系的應用，即利用所述雜色蛤物 種實時熒光PCR特異性檢測體系對雜色蛤物種進行實時熒光PCR特異性檢測，具體步驟如 下： 1.雜色蛤物種特異性檢測引物合成：在寶生物公司合成雜色蛤物種特異性檢測引物5對，其序列(見表5): 表5. PCR擴增雜色蛤的Cox