一種高均一性單價鏈霉親和素四聚體的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種高均一性、無重組標簽的單價鏈霉 親和素四聚體的制備方法。
【背景技術】
[0002] 鏈霉親和素（Streptavidin，SA)是由阿維丁鏈霉菌（Streptomycesavidinii)培 養過程中分泌的一種小分子非糖基化蛋白質，全長編碼區183個氨基酸（aa)，包含24aa的 信號肽，成熟分子159aa。菌體外的天然活性形式為從13至139aa的成熟肽，成熟分子的分 子量為15kD，其天然形式為同源四聚體，分子量60kD，SA的成熟活性結構為127個氨基酸的 多肽，稱為SA核心序列，具有抗蛋白酶的特性。1963年，Dr.Stapley首先發現并報道了SA。 本世紀以來，SA由于其與生物素（Biotin，又稱維生素H、輔酶R)有極高的親和力和特異性 而受到國際生物學和醫學界的高度重視。SA對其配體生物素的親和力（1(T16M/L)比已知的 抗原-抗體的親和力（1(T7~1(T12M/L)高4~6個數量級。高親和力和高特異性并不是SA 的唯一特性，SA與Biotin的結合速度極快，即便是在極低濃度和4°C環境下也是如此。另 外，由于生物素是小分子（31Da)，因而蛋白生物素化幾乎不影響生物功能。SA-Biotin復合 物可以耐受變性劑（如6M鹽酸胍）、去垢劑（如SDS)、90°C高溫和pH3~11的環境。與 其他靶向標簽（如Halo-Tag和SNAP-Tag)相比，SA有更多便利，不論是體外或體內，其可 借助大腸桿菌的生物素連接酶（E.colibiotinligase)將其配體標記到目標蛋白。SA的 這些特性，引發了科學家對SA和其配體Biotin進行各種生物改造的興趣。
[0003] 野生型SA(wtSA)分子與Biotin的結合速度（on-rate)雖然很快，但結合力不夠 穩定持久（highoff-rate)，這使得在連續長時間觀察的動態實驗（如細胞生物學領域）與 影像研宄中應用SA受到阻礙。另一方面，wtSA與生物素的異乎尋常的親和力（1(T16M/L)， 又使得在分離制備時，需要進行變性條件下的洗脫。而且，盡管wtSA對生物素的親和力極 高，但其對某些極具用途的生物素衍生物（如2-亞氨基生物素）則結合力不夠理想（兼容 性不理想）。再有，鏈霉親和素作為一種同源四聚體蛋白，含有四個生物素的高親和力位點， 可能同時結合多個生物素化配體而導致結合配體的聚合。依據上述原因，我們提出了對SA 進行分子改造的必要性。
[0004] 目前，用親和層析法獲得的單價鏈霉親和素四聚體，優點是具有一個Biotin結 合位點，缺點是均一性有待于提高，另外制備過程中使用的外源純化標簽能夠降低SA對 Biotin的親和力。本發明用蛋白酶PK(蛋白酶K)和SU(枯草桿菌蛋白酶）等蛋白酶處理 單價鏈霉親和素四聚體的優點是可以篩選出更穩定的蛋白，同時可以去除有外源純化標簽 (histag)的影響以避免其對配體結合的不利影響，并降低致免疫反應性，本
【發明內容】
目前 還未見有相關報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種高均一性、無重組標簽的、穩定的單價鏈霉親和素四 聚體的制備方法，利用C端帶有His8_tag標簽的重組蛋白和活性缺失突變體構建重組質 粒，感受態細胞轉化質粒得到。
[0006] 本發明的制備方法具體通過以下技術方案實現：
[0007] -種高均一性無重組標簽的單價鏈霉親和素四聚體的制備方法，包括以下步驟：
[0008] 1)將鏈霉親和素野生型和活性缺失突變體分別克隆到pET28a載體中的Ndel和 Xhol酶切位點得到兩個重組質粒；
[0009] 2)重組質粒轉化到E.coli感受態細胞BL21 (DE3)中，細胞培養到0D6QQ= 0. 7時 加入誘導劑IPTG至終濃度為ImM進行誘導，37°C誘導5小時后收集細胞，-20°C凍存； [0010]3)凍存細胞按緩沖液：菌體重量5ml/g的比例使用破菌緩沖液重懸后在冰浴中 進行超聲波破碎，離心后取沉淀使用洗滌緩沖液重懸，在16°C攪拌洗滌30min，離心棄掉上 清，重復洗滌至包涵體的純度達到90%以上；
[0011] 4)將尿素溶解的野生型、突變體鏈霉親和素包涵體以質量比1 :3進行充分混合， 并利用快速稀釋復性法進行包涵體的復性。復性的樣品在4°C條件下攪拌4小時以上，離心 棄掉沉淀，上清中加入硫酸氨固體40 %飽和度，于4°C下攪拌孵育過夜，離心棄掉沉淀，上 清中繼續加入硫酸氨固體至70%飽和度，于4°C下攪拌孵育過夜，離心棄上清，得到的沉淀 即為鹽析作用析出的鏈霉親和素四聚體；
[0012] 5)將析出的鏈霉親和素四聚體重懸于Ni-A緩沖液，離心棄掉沉淀，上清使用NTA 親和純化，使用咪唑濃度梯度進行分離；
[0013] 6)NTA親和層析分離得到的單價鏈霉親和素四聚體，按照樣品/蛋白酶100 :1的 質量比與蛋白酶K(Proteinase K)或者枯草桿菌蛋白酶（Subtilisin)混合，37°C孵育5小 時之后使用排阻層析進行純化，去除蛋白酶降解的不穩定蛋白以及蛋白酶本身，最后獲得 高度均一的、無重組標簽的、穩定的（耐蛋白酶酶切）的單價單價鏈霉親和素四聚體。
[0014] 所述的鏈霉親和素野生型的C端帶有His8-tag標簽的重組蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0015] 所述的鏈霉親和素活性缺失突變體不含His8_tag標簽，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0016] 步驟3)所述的破菌緩沖液為20mMTris-HClpH8. 0、0. 3MNaCl制成；所述的洗滌 緩沖液由 20mMTris-HClpH8. 0、0? 3MNaCl、2MUrea、2%TritonX-100 制成。
[0017] 步驟4)所述的溶解緩沖液由20mM Tris-HCl pH 8. 0、8M Urea制成。
[0018] 所述的快速稀釋復性法進行包涵體的復性過程具體為：于4°C下將溶解的包涵體 逐滴加入復性緩沖液1xPBS中，并充分攪拌，通過控制復性緩沖液的體積以保證復性過程 中尿素的濃度不高于〇. 5M。
[0019]步驟 5)所述的Ni-A緩沖液由20mM Tris-HCl pH8. 0、0. 3M NaCl制成。
[0020] 步驟6)中排阻層析所用緩沖液由20mM Tris-HCl pH8. 0、0. 15M NaCl制成。
[0021] 本發明的有益效果為：本發明提供了一種兼容野生型和突變體的鏈霉親和素，將 野生型、突變體鏈霉親和素包涵體以質量比1 :3混合，復性得到具有活性的多種鏈霉親和 素四聚體，并通過多步分離純化得到的鏈霉親和素單價四聚體，其具有較高的均一性、無重 組標簽，并且能夠耐受多種因素而保持單價四聚體的穩定性。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發明的較佳實施 例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示 的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明 的技術實質對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發明的保護范圍內。
[0023] 實施例1高均一性單價鏈霉親和素四聚體的制備
[0024] (1)鏈霉親和素野生型（C端帶有His8_tag標簽的重組蛋白）和活性缺失突變體 (不含His8_tag標簽）克隆到pET28a載體中的Ndel和Xhol酶切位點。
[0025] (2)重組質粒轉化到E.coli感受態細胞BL21 (DE3)中，細胞培養到0D_=0?7時 加入誘導劑IPTG至終濃度為ImM進行誘導。37°C誘導5小時后收集細胞，-20°C凍存。
[0026] (3)凍存細胞按緩沖液：菌體重量5ml/g的比例使用破菌緩沖液（20mMTris-HCl pH8. 0、0. 3MNaCl)重懸后在冰浴中進行超聲波破碎。破碎后的勻漿，在4°C、38000g下離心 30min后，取沉淀使用洗滌緩沖液（20mMTris-HClpH8.0、0.3MNaCl、2MUrea、2%Triton X-100)重懸后，16°C攪拌洗絳30min，于4°C、38000g下離心30min后棄掉上清。如上重復 洗滌包涵體三次，至此SDS-PAGE分析證實包涵體的純度達到90%以上。
[0027] (4)清洗的包涵體用溶解緩沖液（20mMTris-HClpH8. 0、8MUrea)重懸，室溫下 攪拌3小時至包涵體充分溶