一種紅紫芽茶樹R2R3-MYB基因CsMYB2及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物基因領域，特別涉及一種紅紫芽茶樹R2R3-MYB基因CSMYB2及其 應用。
【背景技術】
[0002] 花青素又稱為花色素（anthocyanidin)，是類黃酮生物合成途徑中最主要的代謝 產物之一，是自然界中重要的水溶性黃酮類色素。植物中的花青素不穩定，常與糖結合以配 糖體的形式存在，形成花色素苷（anthocyanin)。其中糖基供體除了葡萄糖外，還可以被半 乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖及木糖等不同的糖所取代（PanagiotisArapitsas，2008)。由于花 色素發生糖苷化的位點和數目的差異及其甲基化、酰化程度的不同，從而在自然界植物中 形成了各種各樣的花色素苷，以糖苷的形式積累在植物細胞的液泡中。花色素苷屬于黃酮 類化合物，其基本結構有雙鍵存在，在波長范圍分別為465~560nm和270~280nm有最大 光吸收，賦予了植物的花、果實、莖、葉和根等組織產生紅色、粉色、藍色及紫色甚至黑色等 五彩繽紛的色彩（K〇es,R.，2005 ;Winkel-Shirley,B.，2001)。
[0003] 在植物中，花青素的生物合成通常受幾個不同家族的調芐基因調控，如MYB家族、 MYC家族（編碼Bhlh蛋白）和WD40類蛋白家族，這三類轉錄因子在調控其它黃酮類代謝 產物（原花青素與黃酮醇）的合成也起關鍵作用（He，F.，2008;DiX〇n，R.A.，2005)。目 前，通過模式植物擬南芥突變體的研宄，已經分離鑒定出大部分的調芐基因，如MYB家族的 PAP1與PAP2、MYC家族的GL3與EGL3以及WD40家族的TTG1等轉錄因子。這三類轉錄調 節蛋白形成一個三元復合體調節黃酮類途徑中結構基因（Chi,Chs，F3h,與Dfr等）的表達 進而調節擬南芥花青素的生物合成（He,F.，2008 ;Gonzalez，A.，2008 ;Ramsay，N.A.，2003 ; PAYNECT.，2000)。然而，也有一系列的Myb和Myc轉錄因子如MYBL2、MYB4與BHLH32在 擬南芥花青素的生物合成途徑中起著負調控的作用OubosC.，2008 ;Chen，Z. -H.，2007 ; Jin，H.，2000)。在單子葉植物玉米的花青素合成途徑中，其關鍵結構酶基因（CHS、CHI、F3H、 DFR、ANS、LDOX和UFGT)主要受MYB與MYC家族相關轉錄因子的調節，進而調控花青素的生 物合成。
[0004] 紅紫芽茶樹是一種稀有的特色茶樹資源，其芽葉呈紫色、紅色或紅紫色，具有較 高含量的花青素。茶葉作為一種天然的健康飲品，在世界飲料史上具有舉足輕重的地 位。研宄表明，花青素具有抗氧化劑（Bae&Suh，2007)，抗癌（Leeetal.，2009)，抗血 管生成（Bagchi,Sen,Bagchi, &Atalay, 2004)，抗菌（Viskelisetal.，2009)，抗凋亡 (Elisia&Kitts，2008)與促凋亡（Loetal.，2007)等功能特性。
[0005] 褚世林調查發現，在茶樹地方有性群體品種中，紅紫色芽葉占很大比例，但不同季 節有很大差異，如普通群體品種春季有30%左右的芽葉呈現微紅紫色或紅紫色，在夏季則 有88. 7% ;劉富知等在湖南農業大學種植的安化有性群體品種茶樹中，發現有76%的植株 上出現深淺不一的紅紫色芽葉，82. 6%的植株嫩梢中不同程度地含有花青素；周志高等也 發現，紫筍茶株抽出的嫩梢呈亮紫色或紫銅色且性狀可遺傳，并不是由于溫度和土壤條件 的緣故；蕭力爭等根據紫色芽葉的色差計測色值和芽葉花青素的含量水平將茶樹芽葉分成 綠色、淺紫色、中紫色、深紫色和特紫色5個等級，包括特紫色的自選9803和淺紫色的自選 9809;1^1^〇等 [1°]、1^此1(1等則分別對肯尼亞紫芽茶樹花青素的提取與鑒定、茶樹花青素的 生理功能進行了相關研宄報道。劉富知根據群體品種茶樹中濃紅紫芽葉和酸性乙醇反應指 數達4的材料占4. 35%這一比例，推論在某些地方有性群體品種中可以篩選出花青素含量 高的茶樹類型，但以上研宄都沒有進一步的品種選育報道。2005年，云南省茶葉研宄所選育 的遺傳特性穩定、品種性狀純一、無變異的具有紫芽、紫葉、紫莖的"紫娟"茶樹，獲得國家林 業局授予的植物新品種保護權。"紫娟"由云南大葉群體國家級茶樹良種一一勵海大葉茶單 株培育而成，新梢芽葉為紫芽、紫葉、紫莖的嫩梢，且所制干茶和茶湯皆為紫色，花青素含量 約為一般紅芽茶的3倍 [1_2]。廣東省農科院飲用植物研宄所（原茶葉研宄所）于2003年從 云南大葉和鳳凰水仙群體品種中選出約20個紅紫芽品種優良品系，新品系新梢2~4片葉 為紅紫色，隨著葉片的生長與成熟，葉片的紅紫色褪去，轉變為綠色。除丹鳳和紅葉4號等 少數品系外，其他紅紫芽品系芽葉的紅紫色都在夏季最深，說明芽葉色澤同時受外界環境 和遺傳因子的控制。茶樹紅紫化芽葉的形成與花青素的合成代謝及積累密切相關，花青素 含量決定芽葉紫色深淺。相比綠色芽葉，紅紫芽中花青素含量顯著增加，如云南"紫娟"品 種新梢一芽二葉中花青素含量可高達29mg/g，遠高于對照；而廣東紅紫芽茶花青素含量是 對照云大淡綠品種的3. 6~12. 8倍，芽葉紅紫色的深淺與花青素的含量呈正相關。
[0006] 茶樹花青素功能基因分離克隆起步比較晚，相比茶樹花青素合成結構酶基因的進 展，相關調芐基因的研宄更少。陳林波等通過對"紫娟"嫩葉和成熟葉的基因表達進行分析， 篩選到59個差異表達基因，其中在紫色幼嫩葉片中獲得26個上調片段，包括含有AP2結構 的轉錄因子、代謝相關蛋白、信號蛋白等，并指出這些基因可能參與茶樹葉色的調控。王弘 雪克隆了 3個MYB基因，分別命名為CsMYB4-5、CsMYB4-6和CsMYB4-7，并轉化擬南芥pap1-D 突變體植株。馬春雷等利用基因芯片技術對紫芽和綠芽進行分析，篩選到差異表達基因43 個，包括2個可能與花青素合成有關的轉錄因子MYB蛋白和WD40蛋白基因，MYB基因分別為 CsMYBl和CsMYB2,全長分別為1 132和1 020bp，在GenBank的登錄號分別為HQ660373和 HQ660374。定量分析發現CsMYB2在葉片中的相對表達量是根的100多倍，并指出遮蔭處理 能明顯降低葉片中的花青素含量，提高CsMYBl的表達，但對轉錄因子CsMYB2的影響不大， 其與茶樹花青素合成的相關性有待進一步研宄。
【發明內容】
[0007] 為克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種紅紫芽茶樹 R2R3-MYB基因CsMYB2的核苷酸序列。
[0008] 本發明的另一目的在于提供上述紅紫芽茶樹R2R3-MYB基因CSMYB2的氨基酸序 列。
[0009] 本發明的再一目的在于提供上述的紅紫芽茶樹R2R3-MYB基因CSMYB2的應用。
[0010] 本發明的目的通過下述技術方案實現：一種紅紫芽茶樹R2R3-MYB基因CsMYB2,其 核苷酸序列如下所示：
[0011] |ATG|丨GGAAGGGCTCCATGTTGTTCCAAGGTTGGGTTGCATAGAGGTCCATGGACTGCTAGAGAGGA TGCATTGCTCACCAAGTATATTCAGCTTCATGGTGAAGGCAATTGGAGATCTTTGCCTAAAAAAGCTGGTCTACTAA GATGCGGAAAGAGTTGCAGGCTAAGATGGATGAACTATCTAAGACCTGATATCAAGAGAGGGAACATCTCCCCTGAT GAGGATGACCTAATTATCAAAATGCATGCTCTTCTTGGCAACCGATGGTCTCTTATCGCAGGAAGACTACCGGGTCG AACTGATAACGAGATTAAGAACTATTGGAACACCCATCTCAGCAAAAGACTCTTAAGCCAAGGAACCGACCCGAATA CCCACAAAAAAATATCAGATCCTCACCTAAAAGAACCAAAGAAGAGAAGGAGCAACAGCAAAAAGCAAAAAAACAAG TCCAAATCCAATGTTGTAGTGATTGAAAAGCTCAAAGTTCATAACCCAAAGCCCACTAGGATCAAGTCCTTGAGTTC CTTCTCAATGTCAAGGAATGGTAGTTTTGGTTGGACAATTAGTGGCGGTTCTTCATCAAGTCATGAGGGAGACCACA GAGGATCATTACTTGTTGGTACAGAAGTCGTGCATGTTCCATGGTCTGATTTCAAAGATGATGCGGATCATGAAAAT AGGGTTGGCTTTCTTGTTGGTGATGATCATCAAGATCGCGATCTAGTCAACGGTTCGGACCTCGAATGTCATTCTCA ATTGTTGCCAATGTCTGATCACACTCTAGAGAAGCTCTATGAGGAGTACCTACAACTACTCAAGGCAGAAGATGATG TCCAAGTTCAGTTTGATTCCTTTGCTGAATCTTTGCTGATAfTGA[0
[0012] 其中，框中的ATG和TGA分別為CsMYB2核苷酸序列的起始密碼子和終止密碼子。
[0013] 上述的紅紫芽茶樹R2R3-MYB基因CsMYB2,其氨基酸序列如下所示：
[0014] MGRAPCCSKVGLHRGPWTAREDALLTKYIQLHGEGNWRSLPKKAGLLRCGKSCRLRWMNYLRPDIKRGN ISPDEDDLIIKMHALLGNRWSLIAGRLPGRTDNEIKNYWNTHLSKRLLSQGTDPNTHKKISDPHLKEPKKRRSNSKK QKNKSKSNVWIEKLKVHNPKPTRIKSLSSFSMSRNGSFGWTISGGSSSSHE⑶HRGSLLVGTEVVHVPWSDFKDDA DHENRVGFLVGDDHQDRDLVNGSDLECHSQLLPMSDHTLEKLYEEYLQLLKAEDDVQVQFDSFAESLLI〇
[0015] 上述的紅紫芽茶樹R2R3-MYB基因CsMYB2的應用，主要在提高植物的花色素苷積 累方面應用。
[0016] 上述的紅紫芽茶樹R2R3-MYB基因CsMYB2的應用，主要在提高轉基因植物的花色 素苷積累方面應用。
[0017] 所述的轉基因植物優選為轉入CSMYB2基因的植物，更優選為轉入CSMYB2基因的 擬南芥。
[0018] 所述的轉入CsMYB2基因，優選為通過置換反應將CsMYB2連接到pD0NR221質粒與 PB2GW7載體上，獲得重組質粒，將重組質粒轉化農桿菌EHA105菌株感受態細胞；完成轉入 CsMYB2 基因。
[0019] 所述的轉化優選為凍融法轉化方式。
[0020] 本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：
[0021] 1.本發明獲得一種茶樹R2R3-MYB基因CsMYB2的核苷酸序列，并對其氨基酸序列 的結構特征和物種比對進行分析。
[0022] 2.本發明從CsMYB2的氨基酸結構上分析CsMYB2可能具有調控紅紫芽茶樹芽葉花 色素苷生物合成的功能，然后通過轉化擬南芥證實CsMYB2具有調控花色素苷生物合成的 功能。
【附圖說明】
[0023] 圖1是CsMYB2克隆過程的電泳圖；其中，M，DNAMarker(條帶大小分別為2000bp、 1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp);A中 1 泳道為CsMYB2 的 3'RACE片段；B中 2 泳道為 CsMYB2的5'RACE片段；C中3、4泳道分別為CsMYB2的0RF及CsMYB2全長片段。
[0024] 圖2是CsMYB2推導的氨基酸序列的結構分析圖；其中，圖中所用到的序列 基因名稱和GenBank登錄號為：DkMYB4(AB503701)、TcIT2_like_MYB(ADD51352)、VvMYBAl(BAD18977), Vbputati