全人源EGFR ScFv煙草密碼子偏好基因序列及獲得方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于利用植物生物反應器生產一種抗腫瘤藥物的領域，特別涉及一種全人 源EGFRScFv煙草密碼子偏好基因序列及獲得方法和應用。
【背景技術】
[0002] 目前利用化學療法治療癌癥已經成為常規治療方法，但化療有其應用瓶頸。如今 急需另外的醫療方法突破化療的瓶頸。腫瘤生物治療（cancerbiotherapy)成為繼手術、 化療和放療三大經典腫瘤治方法后的第四種方法。表皮生長因子受體（EGFR)是一種廣泛 分布于人體各組織細胞膜上的多功能糖蛋白，EGFR表達異常可以導致細胞信號通路持續活 化、最終導致腫瘤發生（非專利文獻1)。EGFR是一種酪氨酸蛋白激酶型受體，其相對分子 質量約為170 000。廖剛等人認為EGFR在多種惡性腫瘤細胞中存在過表達的現象，EGFR的 過表達甚至突變在腫瘤發生與發展中很關鍵，并與腫瘤的惡性生物學行為和腫瘤患者的不 良預后有著緊密關系。
[0003] EGFR受體常高表達于惡性腫瘤細胞（非專利文獻2)，EGFR已成為腫瘤生物治療 的一個理想靶點。針對EGFR靶點的ScFv藥物的研宄具有廣闊的前景，利用配體或抗體將 治療分子運送到高表達EGFR的腫瘤細胞局部也受到越來越多的關注。利用ScFv作為靶向 分子具有以下優點：分子量小，穿透性較強，能實現人源化，易對它進行改造，可大規模生產 等（非專利文獻3)。目前國內外已經研制出多種ScFv，并用于臨床（非專利文獻4)。
[0004] 近年來靶向EGFR的腫瘤生物治療方法在針對于腫瘤靶向治療的藥物研發及應 用受到了強烈的重視。以EGFR為靶點的治療方式主要有以下兩種：小分子酪氨酸激酶拮抗 劑和單克隆抗體。在腫瘤生物治療中，EGFR這一靶點起關鍵作用。以EGFR為靶點的單克 隆抗體治療，通過現代分子生物學和遺傳學等技術方法在基因及細胞分子水平對其表達、 活性及其效應等多個環節進行有效抑制而達到治療腫瘤的目的，是近年來抗腫瘤治療新的 方法和手段之一。然而，由于目前制備的單克隆抗體多為鼠源性的，在體內易產生人抗鼠的 抗體反應，加之其分子量大，血管通透性差，給臨床應用帶來了一定的困難。而至今尚未見 全人源抗EGFRScFv的構建和應用的報道。
[0005] 現有技術文獻
[0006] 非專利文獻
[0007]非專利文獻1 :MENDELSOHN J，BASELGA J. Epidermal growth factor receptor targeting in cancer[J]. Semin Oncol, 2006, 33(4):369-385.
[0008] 非專利文獻 2:NormannoN,BiancoC,StrizziL,eta. 1TheErbB receptorsandtheirligandsincancer:anoverview[J]?CurrDrug Targets, 2005, 6 (3) : 243-257.
[0009] 非專利文獻3 :趙曉蓉，戴維，彭吉林，黃鶴，袁曉梅，劉靜，朱慧芬，沈關 心.EGFR特異性單鏈抗體與靶細胞結合的特異性[J].鄖陽醫學院學報200625 (4) : 202-204
[0010] 非專利文獻 4:SunC,WirschingP,JandaKD.EnablingScFvsasmultidrug carriers:Adendriticapproach[J].BioorgMedChem, 2003, 11(8):176168.
【發明內容】
[0011] 為克服以上缺陷，本發明利用煙草這一植物生物反應器進行高效的表達全人源 EGFRScFv序列，該發明的基因序列高效表達后具有抗腫瘤作用。
[0012] 本發明目的是由以下技術方案實現的：
[0013] 一種全人源EGFRScFv煙草密碼子偏好基因序列，包括的核苷酸序列見SEQID N01〇
[0014] 本發明還提供了一種全人源EGFRScFv煙草密碼子偏好基因序列的獲得方法，包 括以下步驟：
[0015]a、全人源EGFRScFv基因序列的獲得，通過連接肽（Linkr)將重鏈可變區（VH)DNA 序列與輕鏈全長（VL)DNA序列連接起來，得到VH-L-VL基因序列；
[0016]b、全人源EGFRScFv基因序列的改變，對全人源EGFRScFv基因序列進行煙草密 碼子偏好性基因序列改變，得到改變的VH-L-VL基因序列；
[0017] c、對改變的VH-L-VL基因序列添加酶切位點Xbal、BamHl，TCTAGA為Xbal的酶 切位點，且序列中沒有BamHl的酶切位點，為方便PBI121+GUS的載體構建，選擇Xbal和 BamHl兩個酶切位點，把堿基TCTAGA改動成密碼子頻率次之的密碼子，改為TCAAGG，得到 Xbal_VH_L_VL_BamH1 基因序列；
[0018] d、在Xbal-VH-L-VL-BamHl基因序列兩端加保護堿基，且在ATG后加組氨 酸標簽（組氨酸標簽不可切除）、在5'端的酶切位點內加3個終止碼子，修飾成 XbalHISVH-L-VL-BamHl基因序列，既全人源EGFRScFv煙草密碼子偏好基因序列。
[0019] 進一步的，本發明目的還可以由以下技術方案實現：
[0020] 一種全人源EGFRScFv煙草密碼子偏好基因序列的獲得方法，所述重鏈可變區 (VH)DNA序列包括的核苷酸序列見SEQIDN02。
[0021] -種全人源EGFRScFv煙草密碼子偏好基因序列的獲得方法，所述輕鏈全長（VL) DNA序列包括的核苷酸序列見SEQIDN03。
[0022] 一種全人源EGFRScFv煙草密碼子偏好基因序列的獲得方法，所述連接肽 (Linkr)包括的核苷酸序列見SEQIDN04。
[0023] 一種全人源EGFRScFv煙草密碼子偏好基因序列的獲得方法，所述步驟a所得 VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列見SEQIDN05。
[0024] -種全人源EGFRScFv煙草密碼子偏好基因序列的獲得方法，所述步驟b所得改 變的VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列見SEQIDN06。
[0025] 一種全人源EGFR ScFv煙草密碼子偏好基因序列的獲得方法，所述步驟c所得 Xbal-VH-L-VL-BamHl基因序列包括的核苷酸序列見SEQIDN07。
[0026] -種全人源EGFRScFv煙草密碼子偏好基因序列的獲得方法，所述步驟d所得全 人源EGFRScFv煙草密碼子偏好基因序列包括的核苷酸序列見SEQIDN01。
[0027] 本發明的一種全人源EGFRScFv煙草密碼子偏好基因序列高效表達后具有抗腫瘤 作用。
[0028] 全人源EGFR ScFv(VH-L-VL)煙草密碼子偏好基因序列蛋白質高級結構的預測，通 過ORF Finder預測VH-L-VL的ORF，可知它是一個完整的編碼序列。通過理化性質分析，可 知VH-L-VL是一種穩定蛋白，且還是一種親水性蛋白，通過TMHMM分析，可知VH-L-VL并非 是跨膜蛋白，TargetP對VH-L-VL蛋白的亞細胞定位進行預測，結果表明，VH-L-VL是分泌到 細胞周質的蛋白。以上各種結果符合ScFv的特點。
[0029] 利用植物作為工廠生產重要的藥用蛋白，包括疫苗抗原和治療的單克隆抗體 (mAbs)，有幾個優勢，首先，植物可以產生大量的蛋白質，有效和可持續，并在一定條件下， 可以有顯著的優勢，成本低。其次，植物的生長不需要的動物或人來源的營養素，因此動物 或人類病原體和毒素的污染的風險極低。第三，植物具有類似于哺乳動物的細胞，允許適 當的重組蛋白的翻譯后修飾，可以表達具有功能的產物。將編碼全抗體或抗體片段的基因 導入植物，在植物中可表達出具有功能的抗體，即具有結合特性的全抗體或部分抗體片段。 在植物中表達重組抗體，可以大規模在大田種植，條件相對簡單，價格低廉，外源抗體基因 片段可以整合進入植物染色體中穩定遺傳。植物細胞可以對表達的重組抗體蛋白進行正確 的組裝和翻譯后修飾，其表達產物還能保持良好的生物學特性；同時由于植物表達系統表 達的抗體以二聚體形式存在，因此表達產物的親和力高，有助于全面發揮抗體的功能。
[0030] 本發明的有益效果：
[0031] 本發明的全人源EGFR ScFv煙草密碼子偏好基因序列，克服了鼠源性基因序列在 體內易產生人抗鼠的抗體反應及其它源性基因序列導致的其它不良反應。利用煙草這一植 物生物反應器進行高效表達的全人源EGFR ScFv，煙草中表達的全人源EGFR ScFv的氨基酸 序列和它的原始序列相同，并且能形成類似于人類等哺乳類動物的復雜型糖鏈結構。本發 明對抗體藥物的植物生產具有指導意義，可以大幅度降低抗體藥物的生產成本，具有較高 的經濟效益和社會效益。
【附圖說明】
[0032]圖1為本發明的基因序列在煙草中高效表達后所得蛋白質對乳腺癌細胞增值的 抑制作用結果圖。
【具體實施方式】
[0033] 根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明而不應當也不會限制 權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0034] 實施例1
[0035] 一種全人源EGFR ScFv煙草密碼子偏好基因序列的獲得方法，包括以下步驟：
[0036] a、全人源EGFR ScFv基因序列的獲得，通過連接肽（Linkr)將重鏈可變區（VH)DNA 序列與輕鏈全長（VL)DNA序列連接起來，得到VH-L-VL基因序列；
[0037] 所述重鏈可變區（VH)DNA序列包括的核苷酸序列見SEQ ID N02。
[0038] 所述輕鏈全長（VL)DNA序列包括的核苷酸序列見SEQ ID N03。
[0039] 所述連接肽（Linkr)包括的核苷酸序列見SEQ ID N04。
[0040] 所得VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列見SEQ ID N05。
[0041] b、全人源EGFRScFv基因序列的改變，對全人源EGFRScFv基因序列進行煙草密 碼子偏好性基因序列改變，得到改變的VH-L-VL基因序列；
[0042] 具體操作步驟包括：采用CodonUsageDatabase軟件，得到煙草偏好性密碼 子；用高頻率煙草偏好性密碼子對VH-L-VL基因序列中的密碼子進行替換，得到改變的 VH-L-VL基因序列。
[0043] 所得改變的VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列見SEQIDN06。
[0044] c、對改變的VH-L-VL基因序列添加酶切位點Xbal、BamHl，T