病毒基因組中的高度保守區序列作為設計治療性sliRNA模板的應用
【專利說明】病毒基因組中的高度保守區序列作為設計治療性sIiRNA 模板的應用
[0001] 本申請是申請號為201180050847. 5、申請日為2011年9月19日、2013年4月22日 進入中國國家階段、發明名稱為"病毒基因組中的高度保守區序列作為設計治療性sliRNA 模板的應用"的發明專利申請的分案申請。
[0002] 奪叉引用
[0003] 本申請要求2010年9月20日提交的美國申請第12/886, 446號的權益，該美國申 請的全部內容在此通過引用并入本文。
[0004] 對序列表的引用
[0005] 本申請包括通過EFS-Web以ASCII格式提交的序列表并且該序列表的全部內容在 此通過引用并入本文。在2011年9月19日創建的ASCII副本的名稱為Doc.No. 4170050_1. txt，大小為 9. 28KB。
【背景技術】
[0006] 小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)是帶有特定基因密碼的短雙鏈RNA 片段，功能長度一般為21-23核苷酸。siRNA與互補mRNA特異性結合，使靶定的mRNA降解 并失去功能。這種由siRNA有效介導的轉錄后的基因沉默現象稱之為RNAi(RNA干擾），其 為自然存在于細胞中的防御機制。當雙鏈RNA進入細胞內時，其被切割成帶有21-25個核 苷酸的siRNA片段。所述片段先與細胞內的其它成分結合以形成核酸蛋白復合體，稱之為 RNA誘導的沉默復合物（RISC)。激活的RISC通過堿基配對靶向到同源mRNA上，從而切割 并降解mRNA，由此阻止細胞內特定的基因表達。siRNA不僅廣泛應用于生物醫學研宄，而且 在治療多種疾病如病毒感染、癌癥、血管疾病、神經系統疾病等具有廣闊的前景。
[0007] 年齡相關性黃斑變性（AMD)是50歲以上的人視力不可逆性損害的主要原因之一。 AMD在臨床上分為"干性"和"濕性"兩型，濕性AMD發展快，是引起失明的主要原因。其病 理變化導致嚴重的視力障礙。AMD的表現包括視網膜色素上皮細胞（RPE)功能受損和黃斑 部脈絡膜新生血管（CNV)。在一些嚴重病例中還會出現液體滲出，RPE或神經上皮的脫離， 血管破裂造成出血性脫離。已發現許多細胞因子在CNV的生成過程中發揮著重要的調控 作用，所述細胞因子包括血管內皮細胞生長因子（VEGF)、VEGF受體（VEGFR)、缺氧誘導因子 (HIF)、血管生成素（Ang)和其它細胞因子，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK)及其它。
[0008] 已對RNAi在抑制CNV方面的效力做了測試，Cashman等的研宄表明（CashmanSM 等人，InvestOphthalmolVisSci，2006;47(8) :3496-3504)，將構建在腺病毒表達載體中 的VEGF短發夾RNA(shRNA)玻璃體腔內注射于VEGF165誘導的CNV小鼠模型。該注射治療 可有效地抑制VEGF的過表達并且成功地阻止CNV的形成。證據顯示shRNA腺病毒載體被遞 送（跨膜）至細胞質并引發RISC的活化，使目標RNA降解。由于人們對腺病毒載體在臨床 應用上的顧慮，嘗試使用裸露（無傳輸介質）的VEGFsiRNA使目標基因沉默。結果顯示通 過裸露的"siRNA"抑制VEGF表達確實降低了在小鼠模型中CNV的形成（Reich，S.J等人， Mol.Vis. 2003 ;9 :210 - 216)。
[0009] 本領域仍然需要改良的、基于RNA的抑制劑，用于治療如AMD和CNV的疾病。
【發明內容】
[0010] 一方面，本發明提供了一種調節Toll樣受體（TLR)的sliRNA，該sliRNA含有與病 毒基因組序列的高度保守區的片段具有至少80%同源性的核苷酸序列。在一些實施方式 中，所述核苷酸序列與高度保守區的片段具有至少85%、90%、95%、100%的同源性。在一 些實施方式中，Toll樣受體是Toll樣受體3 (TLR3)。在一些實施方式中，高度保守區位于 病毒基因組的選自5'非翻譯區（UTR)、3'UTR及開放閱讀框（0RF)的區域。在一些實施方 式中，病毒是選自脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒、人腸道孤病毒、微小核糖核酸病毒、腸道病 毒的人類病毒。在一些實施方式中，高度保守區序列位于SEQIDNO: 1的241-263位。在 一些實施方式中，sliRNA包括雙鏈RNA，該雙鏈RNA可為平末端或可具有3'或5'突出端。 在一些實施方式中，sliRNA的長度為14-25核苷酸。在一些實施方式中，sliRNA包括位于 核苷酸序列的3'端的1~2個DNA堿基。
[0011] 另一方面，本發明提供sliRNA，該sliRNA包含具有以下序列的雙鏈RNA分子：
[0012] 正義鏈：5' -UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUANn-3'（SEQIDN0:14)
[0013]反義鏈：5' -UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUANn-3'，（SEQIDN0:15)
[0014] 或：
[0015]正義鏈：5' -AGGUACUUCGAGAAGCCNn-3'（SEQIDN0:28)
[0016]反義鏈：5' -GGCUUCUCGAAGUACCUNn-3'（SEQIDN0:29)
[0017]其中，N是選自胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶及其脫氧形式的核苷酸，并且，其 中，n是0~2的整數。在一些實施方式中，N是dT，且n為2。在一些實施方式中，n為2。 [0018] 再一方面，本發明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本文提供的 sliRNA，以及藥學上可接受的載體。
[0019] 另一方面，本發明提供了一種治療病理性血管生成相關疾病的方法，所述方法包 括將藥學有效劑量的本文提供的sliRNA給藥至需要這種治療的受治者。在一些實施方式 中，這些疾病選自：老年性黃斑變性（AMD)、糖尿病視網膜病變及癌癥。
[0020] 另一方面，本發明提供了一種設計sliRNA的方法，所述方法包括從病毒基因組序 列中選擇高度保守區，并測試包含與高度保守區的片段具有至少80%、85%、90%、95%、 1〇〇%同源性的核苷酸序列的1?仏調節1'1^(如1'1^3)活性的能力。
[0021] 通討引用并入本f
[0022] 如同將各單獨的出版物、專利或專利申請通過引用單獨并入本文中一樣，本文所 提及的所有出版物、專利和專利申請均以相同的程度通過引用并入本文。
【附圖說明】
[0023] 本發明的新特征由所附的權利要求書中的具體內容來闡述。為了更好地理解本發 明的特征和優點，以下將利用本發明原理通過說明書實施例和附圖進行詳細闡明。
[0024] 圖1是鞏膜_脈絡膜/視網膜色素上皮細胞（RPE)鋪片的熒光顯微照片（放大40 倍）：綠色通道圖片顯示鬼筆環肽（Phalloidin)陽性的RPE細胞呈均勻一致的六邊形緊密 排列（圖la)，紅色通道圖片顯示同工凝集素_B4(iB4)_陽性的血管內皮細胞（圖lb)，綠 色-紅色-藍色通道的疊加圖像顯示出RPE、血管內皮細胞和4'，6'-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)標記的細胞核的重疊（圖lc)。
[0025] 圖2a為在C57BL/6J小鼠體內通過激光光凝作用誘導的CNV小鼠模型的眼球剖面 圖。圖右下方箭頭指示光凝斑在視乳頭旁。圖2b為氪激光光凝后5min的眼底照片，箭頭 指示光凝斑和視網膜水腫；圖2c是顯微鏡下下觀察到的鞏膜-脈絡膜/RPE的鋪片顯微照 片（放大100X)，箭頭指示光凝斑在視神經旁。
[0026] 圖3是用共焦激光視網膜斷層掃描儀記錄的顯微照片：眼底熒光血管造影（FFA) 檢查顯示C57BL/6J小鼠在氪激光光凝后發生血管改變。光凝后7天，可在盤狀熒光素滲漏 處觀察到光凝斑（圖3a);光凝后14天，可在熒光素滲漏處明顯地觀察到光凝斑（圖3b) (圖中箭頭所指為光凝部位）。光凝后28天，在熒光滲漏處無明顯光凝斑，并且出現瘢痕化 (圖 3c)。
[0027]圖4是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片的熒光顯微照片（放大100倍）：激光誘 導的灼傷位于如圖4d_f所示的環形缺損區內。在光凝后第4天，缺損區內出現一些細胞碎 片以及細胞核碎片（圖4g_i)。到第7天時，在激光損傷區可以看到同工凝集素-B4染色 的CNV網。RPE細胞覆蓋CNV復合體區域（圖4j-l)。第14天和第28天CNV面積無明顯 不同，但是與第7天的CNV面積相比明顯增加。
[0028]圖5是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。激光光凝 后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI(藍色）、同工凝集素-B4(紅色）及鬼筆環肽（綠 色）分別標記細胞核、內皮細胞和RPE。
[0029] 圖6是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。用5%葡萄 糖溶液處理的激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI(藍色）、同工凝集素-B4 (紅 色）及鬼筆環肽（綠色）分別標記細胞核、內皮細胞和RPE。
[0030]圖7是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。用阿瓦斯 汀（Avastin)處理的激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI(藍色）、同工凝集 素-B4(紅色）及鬼筆環肽（綠色）分別標記細胞核、內皮細胞和RPE。
[0031] 圖8是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。用siEv70_l 處理的激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI(藍色）、同工凝集素-B4 (紅色） 及鬼筆環肽（綠色）分別標記細胞核、內皮細胞和RPE。
[0032] 圖9是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。用siEv70_2 處理的激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI(藍色）、同工凝集素-B4 (紅色） 及鬼筆環肽（綠色）分別標記細胞核、內皮細胞和RPE。
[0033]圖10是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。用 siEv70_3處理的激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI(藍色）、同工凝集 素-B4(紅色）及鬼筆環肽（綠色）分別標記細胞核、內皮細胞和RPE。
[0034]圖11是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。用 siEv70_4處理的激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI(藍色）、同工凝集 素-B4(紅色）及鬼筆環肽（綠色）分別標記細胞核、內皮細胞和RPE。
[0035]圖12是在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。用 siEv70_5處理的激光光凝后第7天的樣品用作對照。由熒光DAPI(藍色）、同工凝集 素-B4(紅色）及鬼筆環肽（綠色）分別標記細胞核、內皮細胞和RPE。
[0036] 圖13顯示用ImageJ圖像分析軟件定量分析CNV的平均面積，圖中顯示每個處理 組均小于陰性對照組；siEv70_2處理組明顯小于其它處理組。
[0037] 圖14是不同處理組VEGFmRNA表達水平：激光誘導的未處理的眼內的VEGFmRNA 水平明顯高于其它處理組，在處理組中，siEv70_2處理組的VEGFmRNA水平為統計學意義 上的最低水平。
[0038] 圖15顯示實時PCR檢測不同處理組TLR3的mRNA水平：siEv70_2處理組的 TLR3mRNA水平高于對照組。其它處理組與對照組相比沒有明顯差異。siEv70_6(DNA:RNA 雜交體）激活TLR3能力弱于具有同樣序列的dsRNA(siEV70_2)。
[0039] 圖16顯示實時PCR檢測不同處理組IL12amRNA水平：siEv70_2處理組的IL12a mRNA水平高于對照組。其它處理組與對照組相比沒有明顯差異。siEv70_6(DNA:RNA雜交 體）激活IL12a能力弱于具有同樣序列的dSRNA(SiEv70_2)。
[0040] 圖17a和17b顯示了病毒基因組的高度保守區。
[0041] 圖18a是pNF-kB-TA-luc的質粒圖譜。圖18b是不同處理組激活的NF-kB的不 同水平。
[0042] 圖19a顯示在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微圖片（放大100X)。用 siEv70_6處理的激光光凝后第7天的樣品作為對照。細胞核、內皮細胞和RPE分別用熒光 DAPI(藍色）、同工凝集素-B4 (紅色）和鬼筆環肽（綠色）標記。siEv70_6(DNA:RNA雜交 體）的CNV抑制效力弱于具有同樣序列的dsRNA(siEv70_2)。圖19b顯示在顯微鏡下觀察 到的脈絡膜鋪片熒光顯微圖片（放大100X)。用siEv70_7處理的激光光凝后第7天的樣 品作為對照。細胞核、內皮細胞和RPE分別用熒光DAPI(藍色）、同工凝集素-B4 (紅色）和 鬼筆環肽（綠色）標記。沒有觀察到明顯的CNV抑制。
[0043] 圖20顯示了經幻以￡￥70_2、8)阿瓦斯汀和〇5%葡萄糖刺激后觀察到的主動脈 環內皮發芽情況。
[0044] 圖21顯示在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微圖片（放大100X)。在CNV 小鼠中評價注射siEv70_2抑制激光誘導的CNV的劑量效應關系。細胞核、內皮細胞和 RPE分別用熒光DAPI(藍色）、同工凝集素-B4(紅色）和鬼筆環肽（綠色）標記。與未 處理組（圖21a-c)和陰性對照組（圖21d-f)相比，siEv70_2(2yg)(圖21m-〇)處理組， siEv70_2(10yg)(圖21p-r)處理組和poly(I:C)陽性對照組（圖21g-i)的CNV面積明顯 減少。siEv70_2 (0. 2yg)處理組未觀察到CNV抑制效果（圖21j-1)。
[0045] 圖22顯示了CNV面積的盒須圖。Y軸表示CNV的面積，用平方微米（ym2)表示。 每個點對應一個CNV缺損（總數為 247)，包括siEv70_2(0. 2yg)(n= 41)、siEv70_2(2yg) (n= 52)、siEv70_2 (10yg)(n= 35)、poly(I:C)(n= 39)、GS(n= 40)和未處理組（n= 40) 〇
[0046] 圖23顯示在顯微鏡下觀察到的脈絡膜鋪片熒光顯微圖片（放大100倍）。在激 光誘導的CNV小鼠中評價玻璃體內注射BM01對CNV的抑制效果。細胞核、內皮細胞和RPE 分別用熒光DAPI(藍色）、同工凝集素-B4(紅色）和鬼筆環肽（綠色）標記。與未處理組 (圖23&-(：)和陰性對照組（圖23(1-0相比，在811〇1處理組和口〇17(1 :〇處理組（圖23」-1 和圖23g-i)中CNV被明顯抑制。
[0047]圖24顯示CNV面積的盒須圖。Y軸表示CNV的面積，用平方微米（ym2)表示。每 個點對應一個CNV缺損（總數為 155)，包括BM01(n= 36)、poly(I:C)(n= 39)、GS(n= 40)和未處理組（n= 40)。
【具體實施方式】
[0048] 下面參考實施例以舉例說明的目的對本發明的幾個方面進行描述。應當理解的 是，以下列出的許多具體細節、關系和方法用以完整理解本發明。然而，相關領域的普通技 術人員將容易地認識到，本發明可不通過具體描述中的一個或一個以上方法來實施而以其 它方法實施。另外，本發明并不限于所示的行為或事件的順序，因為一些行為可能以不同的 順序和/或與其它行為或事件同時出現。此外，并不要求所有示出的動作或事件均根據本 發明的方法來實施。
[0049] 本文使用的術語是用于描述特定實施方式，而無意限定本發明。除非另有明確說 明，本文所用的單數形式（"a"，"an"和"the"）也意在包括復數形式。此外，術語"包括"、 "包含"、"具有"、"有"、"帶有"或同類用法用在【具體實施方式】和/或權利要求書中，這些術語 意在包括與術語"包括"類似的方式。
[0050] 術語"約"或"大約"是指由本技術領域普通技術人員所確定的特定值的可接受的 誤差范圍，該誤差范圍部分取決于該值是如何被檢測或確定的，即，測量系統的限制。例如， 本領域中"大約"可意味著每次實施在1或1個以上標準偏差以內。可選地，"大約"可意味 著高達給定值的20%，優選地為高達給定值的10%，更優選地為高達給定值的5%，并且還 更優選地為高達給定值的1%。可選地，對于生物系統或過程而言，該術語可意味著在一個 數量級之內，優選地為某個值的5倍之內，更優選地為某個值的2倍之內。在本申請和權利 要求書中對具體值進行描述的條件下，除非另有說明，認為術語"約"是指在特定值的可接 受的誤差范圍內。
[0051]I.小配體RNA
[0052] -方面，本發明提供了與用于調節Toll樣受體（TLR)的sliRNA有關的組合物和 方法，該RNA包括與病毒基因組序列的高度保守區的片段具有至少80%同源性的核苷酸序 列。
[0053] 本文所述的小配體RNA(sliRNA)是指作為TLR配體的RNA。
[0054] 術語"調節"或"調節表達"是指編碼基因的核酸分子（如DNA或RNA)的量或水 平升高（刺激）或降低（抑制）。抑制通常為調節表達的優選形式，并且mRNA通常為優選 的靶核酸。
[0055]Toll樣#體
[0056]Toll樣受體（TLR)在識別病原體成分以及隨后的激活先天免疫反應中發揮重要 作用，然后所述先天免疫反應的激活引發適應性免疫反應的產生。TLR由引起與病原相關分 子模式（PAMP)結合的大的胞外結構域、跨膜區結構域和與分子結合并啟動細胞免疫反應 的細胞內Toll/白介素-1受體（TIR)結構域組成。在哺乳動物體內已鑒別出至少10種特 異性識別所有主要類別的病原體的TLR成員，在小鼠中已鑒別出11種特異性識別所有主要 類別的病原體的分子模式的TLR成員。TLR與親水性核酸至LPS范圍內的多種多樣的配體 結合，而且，異源二聚作用擴大了配體范圍。TLR2和TLR4識別細菌細胞成分。TLR6與TLR2 結合識別多種細菌細胞壁成分（Mariotti等人，Diversity2009, 1，7-18)。
[0057] 在一些實施方式中，Toll