一種焦磷酸測序文庫的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程及分子生物學領域，具體涉及一種焦磷酸測序文庫的構建方法。
【背景技術】
[0002]焦磷酸測序技術(pyrosequencing)是一種新型的酶聯級聯測序技術，焦磷酸測序法適于對已知的短序列的測序分析，其可重復性和精確性能與SangerDNA測序法相媲美，而速度卻大大的提高。焦磷酸測序技術產品具備同時對大量樣品進行測序分析的能力，為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進行單核苷酸多態性研宄和臨床檢驗提供了非常理想的技術操作平臺。
[0003]該技術進行改進后可以滿足上百個核苷酸序列的測序工作，這樣該技術又可以滿足對重要微生物的鑒定與分型，特定DNA片段的突變檢測和克隆鑒定等方面的應用。焦磷酸測序技術是由3種或4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應。焦磷酸測序技術的原理是:引物與模板DNA退火后，在幾種酶的協同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。
[0004]現有技術中，構建高通量測序文庫的方法包括:將基因組DNA片段化；將DNA片段進行末端修復；在經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A ;將具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連；利用特異性探針對所述連接產物進行雜交捕獲，以便獲得目的片段；將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理，以便將所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶；將經過轉換的目的片段進行PCR擴增；分離純化擴增產物，該擴增產物構成高通量測序文庫。采用本發明的構建高通量測序文庫的方法及其應用，能夠方便有效地構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫。現有技術還存在建庫效率較低，試劑、樣品損耗大，信息不完整的問題，需要構建新方法來解決。
【發明內容】
[0005]本發明的一個目的是一種焦磷酸測序文庫的構建方法，包括以下步驟:
(1)樣品DNA提取及定量；
(2)DNA片段化、純化及片段選擇:DNA片段化，進行目的片段的純化、回收，片段的定量和選擇；
(3)末端補平，加A尾:對DNA進行末端補平，在3’端加A尾；
(4)Y接頭連接:接頭包括正向接頭和反向接頭，正向接頭和反向接頭退火形成一個部分互補配對的Y型接頭；
(5)在接頭上設計多個標簽，可以一次處理多個樣品；
(6)小片段去除;
(8)PCR擴增，獲得擴增產物，即為雙鏈DNA文庫； (9)變性為單鏈，使雙鏈DNA文庫變為焦磷酸測序文庫。
[0006]所述回收為2.5%瓊脂糖凝膠電泳膠回收或Double SPRI方法回收，優選為2.5%瓊脂糖凝膠電泳膠回收。
[0007]所述接頭為接頭a:
正向接頭:5' GCAAGTCTCGATTGGAGCTCTGCTCCAGTGCATCACT 3'，
反向接頭:3' GTACATGCACGACTCAGTCCTGATCCGTAGTGAp5'。
[0008]所述接頭a的標簽為GCATCACT和CGTAGTGA。
[0009]所述接頭為接頭b:
正向接頭:5' GTCGTACAGCTAGTCCTGAGGATGCAGTTCACTAGT 3'，
反向接頭:3' CCTAGCTGCATACGTCACACGAGTCAGTGATCTp 5'。
[0010]所述接頭b的標簽為TCACTAGT和AGTGATCT。
[0011]所述的標簽為96個。
[0012]所述定量使用Qubit焚光儀，定量檢測的標準為50 μ g/ μ I以上。
[0013]所述DNA片段化使用Covaris超聲波打斷儀。
[0014]所述目的片段的純化采用Qiagen PCR純化試劑盒。
[0015]所述小片段去除使用磁珠純化法，磁珠純化后的DNA，A260/A280的比值在1.85以上。
[0016]所述PCR擴增的擴增混合液中包含Mn2+和Mg 2+，Mn2+的濃度為0.60-1.10 mmol/L，Mg2+的濃度為 0.80-1.20mmol/Lo
[0017]所述變性的溫度為93_95°C，時間為3分鐘以上，優選為3_5分鐘。
[0018]所述小片段去除使用磁珠純化法，所述磁珠為AMPure磁珠。
[0019]本發明中的Y接頭，節省了篩選不同連接產物的時間，提高了建庫效率。本發明構建的文庫容量大，與待測核酸配對的成功率高。測序接頭序列長度較長，連接效率高。使用本發明構建的測序文庫，能夠簡單、高效地構建高通量測序文庫，高效的利用測序板，提高了文庫構建的成功率，降低了樣品和試劑的損耗。得到的測序文庫純度高、信息完整，能夠高效地捕獲目的片段，獲得精確的測序結果。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
(1)樣品DNA提取及使用Qubit熒光儀定量，濃度為81μ g/ μ I ;
(2)DNA片段化、純化及片段選擇:使用Covaris超聲波打斷儀使DNA片段化，進行目的片段的純化、回收，片段的定量和選擇，純化采用Qiagen PCR純化試劑盒，使用Qubit焚光儀定量，濃度為64 μ g/μ I ；
(3)末端補平，加A尾:對DNA進行末端補平，在3’端加A尾；
(4)Y接頭連接，接頭為接頭b:
正向接頭:5' GTCGTACAGCTAGTCCTGAGGATGCAGTTCACTAGT3'，
反向接頭:3' CCTAGCTGCATACGTCACACGAGTCAGTGATCTp 5'。
[0021]標簽為TCACTAGT和AGTGATCT，正向接頭和反向接頭退火形成一個部分互補配對的Y型接頭； (5)在接頭上設計96個標簽，可以一次處理96個樣品；
(6)使用AMPure磁珠純化法去除小片段，磁珠純化后的DNA，A260/A280的比值為1.92 ；
(7)PCR 擴增，每 Iml 擴增混合液中包含 0.90Xl(T3mmol MgCljP 0.80 X 1(T3 mmolMnCl2，還包括 60 μ I DNA 聚合酶、150 μ I dNTP、150 μ I 引物、180 μ I emPCR 助劑和 100 μ I1X反應液，余量為水，獲得的擴增產物，即為雙鏈DNA文庫；
(8 )溫度為95 °C，時間為4分鐘，使雙鏈DNA文庫變為單鏈DNA文庫。
[0022]實施例2
(1)樣品DNA提取及使用Qubit熒光儀定量，濃度為96μ g/ μ I ;
(2)DNA片段化、純化及片段選擇:使用Covaris超聲波打斷儀使DNA片段化，進行目的片段的純化、回收，片段的定量和選擇，純化采用Qiagen PCR純化試劑盒，使用Qubit焚光儀定量，濃度為71 μ g/μ I ；
(3)末端補平，加A尾:對DNA進行末端補平，在3’端加A尾；
(4)Y接頭連接，接頭為接頭a:
正向接頭:5' GCAAGTCTCGATTGGAGCTCTGCTCCAGTGCATCACT 3'，
反向接頭:3' GTACATGCACGACTCAGTCCTGATCCGTAGTGAp 5'，
標簽為GCATCACT和CGTAGTGA，正向接頭和反向接頭退火形成一個部分互補配對的Y型接頭；
(5)在接頭上設計96個標簽，可以一次處理96個樣品；
(6)使用AMPure磁珠純化法去除小片段，磁珠純化后的DNA，A260/A280的比值為1.89 ；
(7)PCR 擴增，