口服重組幽門(mén)螺桿菌疫苗的純化工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種口服重組幽門(mén)螺桿菌疫苗的純化工藝。技術(shù)背景
[0002]幽門(mén)螺桿菌pylori, H.pylori')是一種革蘭氏陰性、微需氧的細(xì)菌，與慢性胃炎、消化性潰瘍和胃腺癌密切相關(guān)。漢感染是最常見(jiàn)的慢性感染病之一，已造成全世界50%以上的人口感染，在中國(guó)，/Z ori感染者已超過(guò)6億。H.的毒素和有毒物質(zhì)不僅能破壞胃粘膜，還能使機(jī)體產(chǎn)生炎癥和免疫反應(yīng)，影響胃酸的分泌，最終導(dǎo)致一系列疾病的形成。
[0003]1994年世界衛(wèi)生組織已將/Z列為I類(lèi)致癌因子(grade carinogen)?，F(xiàn)階段臨床上主要采用抑酸劑和二種或三種抗生素治療感染，但存在明顯不足，包括療效不穩(wěn)定、易復(fù)發(fā)、易產(chǎn)生耐藥性、毒副反應(yīng)大和醫(yī)療費(fèi)用高，最大的缺陷是不能根驗(yàn)、H.pylori。如果能夠成功地研制出一種既有預(yù)防功能又有治療作用的疫苗，將成為防止/Z感染的高效生物制劑，并具有十分重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)效益。
[0004]由于/Z疫苗蘊(yùn)藏著巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，早在二十世紀(jì)80年代就有漢疫苗的研宄。現(xiàn)有疫苗主要由以下五種形式:(1)全菌活疫苗，是較為傳統(tǒng)的疫苗，其抗原成分復(fù)雜，含有漢的所有抗原成分，免疫應(yīng)答效率高，但是其特異性不高、易發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，具有致癌的潛在可能性，因此，眾多研宄者不鼓勵(lì)發(fā)展/Z
全菌疫苗；(2)亞單位疫苗，是漢/7_F7ori疫苗研宄的重點(diǎn)，其抗原成分清楚、安全性好、特異性強(qiáng)，常見(jiàn)的亞單位疫苗的抗原主要包括尿素酶(UreA、UreB)、空泡毒素(VacA)、毒素相關(guān)蛋白(CagA)、粘附素(BabA、HpaA)等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，選擇尿素酶作為疫苗抗原的研宄報(bào)道占H.疫苗研宄文獻(xiàn)的70%以上，因此尿素酶已成為H.疫苗首選亞單位抗原；
(3)聯(lián)合疫苗，具有兩種或多種抗原成分。單價(jià)疫苗存在免疫原性弱、免疫效果差等缺點(diǎn)，而聯(lián)合疫苗可獲得比單價(jià)疫苗較好的免疫保護(hù)效果，能明顯提高動(dòng)物的免疫保護(hù)率；(4)核酸疫苗，屬于第三代疫苗。與常規(guī)疫苗相比具有生產(chǎn)制備簡(jiǎn)便、高效、廉價(jià)、無(wú)致病性、能激發(fā)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn)；(5)表位疫苗，是疫苗發(fā)展的新方向。表位疫苗是采用抗原表位制備而成的疫苗。表位疫苗具有特異性高、免疫原性強(qiáng)等特點(diǎn)，是漢/y^ori疫苗設(shè)計(jì)的新思路，具有較好的應(yīng)用前景(楊武晨，郭紅.幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位的疫苗研宄進(jìn)展.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)[J]，2011，27 (12):1139-1142)。
[0005]現(xiàn)有的H.疫苗免疫預(yù)防或治療效果均不理想，其可能的原因是:(I)疫苗抗原的選擇與組成不合理；(2)免疫佐劑活性不足，存在安全隱患；(3)免疫投遞途徑與方式不確定，使得免疫應(yīng)答強(qiáng)度較弱(吳超，李海波等.一種幽門(mén)螺桿菌多表位融合蛋白及其制備的多表位疫苗.中國(guó)，201210330695.0，212.12.26)。由于漢疫苗項(xiàng)目難度較大，絕大部分還集中在小鼠及靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物身上試驗(yàn)，迄今為止，僅有幾家研宄單位分別進(jìn)行了疫苗的I或II期臨床試驗(yàn)。1999年由Orovax公司研發(fā)的重組H.尿素酶治療性疫苗進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)，雖然有較好的保守性抗原和耐受性，但是需佐劑，且需多劑服用；Oravax公司研宄的表達(dá)尿素酶的監(jiān)督沙門(mén)菌進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)，其服用簡(jiǎn)單，未產(chǎn)生明確的粘膜免疫反應(yīng);Antex B1logies公司研制的滅活全菌抗原疫苗進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)，具有較全的免疫性，但制備困難，安全性需進(jìn)一步考察(鄒全明.幽門(mén)螺桿菌疫苗的研宄進(jìn)展.胃腸病學(xué)[J]，2007，12 (9):567-570)。因此，研制出一種用于漢疫苗免疫預(yù)防的藥物就顯得尤為重要了。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種口服重組幽門(mén)螺桿菌疫苗的純化方法。該方法將裂解的包涵體蛋白在陰離子交換層析柱中進(jìn)行NaCl濃度的梯度洗脫。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:該方法簡(jiǎn)捷、省時(shí)、純度高，易于工業(yè)化生產(chǎn)，適用于口服重組幽門(mén)螺桿菌疫苗的制備，所獲目的蛋白純度經(jīng)高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)，純度可達(dá)到98%以上，應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)中將具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。
[0007]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種口服重組幽門(mén)螺桿菌疫苗的純化工藝，用發(fā)酵方式高密度表達(dá)LTB-UreB后，采用高壓破菌、洗滌、裂解、陰離子交換柱層析、超濾、凝膠過(guò)濾層析技術(shù)，獲得高純度的LTB-UreB疫苗蛋白。
[0008]進(jìn)一步改進(jìn)的具體操作步驟如下:
(O高壓破菌:將高效表達(dá)LTB-UreB融合蛋白的大腸桿菌菌體用三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)緩沖液懸浮，充分混合均勻后，采用高壓均質(zhì)機(jī)破菌，高速離心后收集沉淀，即包涵體；
(2)洗滌:將步驟(I)所得包涵體采用洗滌液I(10mmol/L Tris-HCl,1% Tween 80,pH6.0 ?9.0)、洗滌液II (10mmol/L Tris_HCl、2 ?3mol/L Urea、pH 6.0 ?9.0)進(jìn)行洗滌，
高速離心，收集沉淀；
(3)裂解:將步驟(2)獲得的沉淀利用裂解液(50mmol/LTris-HCl、6?8mol/L Urea，pH 6.0?9.0)變性裂解過(guò)夜；
(4)Q FF層析純化:選擇Q FF層析進(jìn)行初步純化，使用平衡液(50mmol/L Tris-HCl,6?8mol/L Urea, pH 6.0?9.0)進(jìn)行Q-FF層析柱平衡，利用含有不同濃度NaCl的平衡液進(jìn)行梯度洗脫；
(5)超濾:將步驟(4)所獲得的蛋白樣品使用超濾膜包進(jìn)行濃縮；
(6)G-50層析純化:將上述所得的蛋白樣品采用G-50層析進(jìn)行純化，利用NaHCO3緩沖液進(jìn)行平衡和洗脫。
[0009]進(jìn)一步改進(jìn)在于:所述步驟(I)使用600?800bar高壓破菌技術(shù)，破菌率彡99%，高速離心獲得包涵體。
[0010]進(jìn)一步改進(jìn)在于:所述步驟(2)所述采用洗滌液1、洗滌液II洗滌包涵體二次。
[0011]進(jìn)一步改進(jìn)在于:所述步驟(3)采用pH 6.0?9.0的裂解液進(jìn)行變性裂解，于10?18 °C攪拌過(guò)夜。
[0012]進(jìn)一步改進(jìn)在于:步驟(4)所述陰離子交換層析使用的填料為Q Sepharose FastFlow，采用Q-FF層析進(jìn)行目的蛋白LTB-UreB的純化。
[0013]進(jìn)一步改進(jìn)在于:步驟(5)純化的目的蛋白超濾濃縮至蛋白濃度為3?4 mg/mL。
[0014]進(jìn)一步改進(jìn)在于:步驟(6)采用G-50層析進(jìn)行脫鹽和除尿素，使得蛋白質(zhì)復(fù)性。
[0015]通過(guò)上述工藝處理制備的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果表明其純度彡98%，分子量約為75kD± 10% ；HPLC檢測(cè)純度多98%，且目的蛋白圖譜重視性好；等電聚焦電泳顯示，目的蛋白的等電點(diǎn)為5.0?7.0之間。將所述融合蛋白通過(guò)凍干工藝制成口服重組幽門(mén)螺桿疫苗，口服免疫BALB/c小鼠，通過(guò)先免疫后攻毒方式對(duì)疫苗預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，通過(guò)上述工藝純化的目的蛋白能刺激小鼠產(chǎn)生特異性SlgA分泌，并且能夠有效降低小鼠胃內(nèi)幽門(mén)螺桿菌的定植，具有顯著的保護(hù)效果，可以預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染。
[0016]綜上所述，通過(guò)上述工藝純化的LTB-UreB融合蛋白純度高，易于工業(yè)化生產(chǎn)，并能夠有效的預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染。
[0017]
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是目的蛋白LTB-UreB洗滌及裂解樣品SDS-PAGE檢測(cè)圖，其中，泳道1，2:包涵體二次洗滌上清液結(jié)果；泳道3，4:包涵體裂解液(純化前樣品);泳道5:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)。
[0019]圖2是目的蛋白LTB-UreB的Q-FF層析SDS-PAGE檢測(cè)圖，其中，泳道1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker);泳道2，3，4:采用42mmol/L NaCl的平衡液洗脫獲得的目的蛋白；泳道5，6:采用55mmol/L NaCl的平衡液洗脫獲得的目的蛋白。
[0020]圖3是目的蛋白LTB-UreB的G-50層析SDS-PAGE檢測(cè)圖。其中，泳道1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker);泳道2:為純化后目的蛋白。
[0021 ] 圖4是目的蛋白LTB-UreB的HPLC檢測(cè)圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為了加深對(duì)本發(fā)明的理解，下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，該實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
[0023]實(shí)施例一菌體破碎
稱(chēng)取工程菌2000g，按I:10的比例加入1mmoI/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，充分混勾后用高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體，于700bar破菌3次，采用管式離心機(jī)9000rpm離心，流速I(mǎi)L/min，沉淀即為粗包涵體。鏡檢細(xì)菌破碎率多99%ο
[0024]包涵體的洗滌及裂解
(I)稱(chēng)取300g包涵體，按1:10的比例加入洗滌液I，高速分散器完全分散后，混合攪拌20min，5000rpm離心40min，收集沉淀。
[0025](2)向沉淀中加入洗滌液II，高速分散器完全分散后，混合攪拌均勾，5000rpm離心40min，收集沉淀。
[0026](3)按1:10的比例向沉淀中加入包涵體裂解液，置于15°C攪拌過(guò)夜，7000rpm離心50min，收集上清，用于Q-FF層析。
[0027]經(jīng)二次洗滌后，包涵體中的雜蛋白顯著減少，裂解過(guò)夜后包涵體以可溶性蛋白的形式存在，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白純度> 40%。
[0028]陰離子交換柱層析(Q-FF層析)
(I)采用I倍柱體積I mol/L NaCl、lmol/L NaOH溶液處理Q-FF層析柱，并連接紫外檢測(cè)儀和便攜記錄儀。利用3倍柱體積的平衡液平衡Q-FF層析柱。
[0029](2)上樣后，采用含有30mmol/L、42mmol/L、55mmol/L NaCl的平衡液進(jìn)行梯度洗脫，在紫外檢測(cè)條件下，分段收集蛋白樣品。30mmol/L NaCl的平衡液主要作用在于除雜蛋白，目的蛋白LTB-UreB主要集中在42mmol/L NaCl洗脫峰的峰后和55mmol/L NaCl洗脫峰的峰前。經(jīng)檢測(cè)，Q-FF層析下樣目的蛋白純度多98%。將純化蛋白超濾濃縮至蛋白濃度為3?4mg/mL，4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0030]凝膠過(guò)濾層析(G-50層析)
使用5倍柱體積lmol/L