一種采用超濾法輔助硫酸銨鹽析提取乳過氧化物酶的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種提取乳過氧化物酶的方法，特別涉及一種采用超濾法輔助硫酸銨 鹽析提取乳過氧化物酶的方法，本發明屬于乳過氧化物酶的提取制備技術領域。
【背景技術】
[0002] 乳過氧化物酶（lactoperoxidase，以下簡稱LP)是動物乳中分泌的一種氧化還原 酶，并在保護哺乳期乳腺和預防新生嬰兒的腸道病原微生物扮演著一個重要的角色，LP能 夠催化內源的硫氰酸鹽（SCN-)氧化成具有抗菌性的硫氰酸鹽（0SCN-)。牛乳中存在的乳 過氧化物酶，它能夠使鹵化物氧化或在過氧化氫存在下氧化硫氰酸鹽而形成抗菌介質。乳 過氧化物酶攜帶Fe3+_血紅素蛋白，它存在于哺乳動物生物液體，如牛奶，唾液和眼淚中。 LP分子量為85kDa，等電點為8. 0-8. 5,在pH值為6. 5時LP帶正點，其在乳清中的含量為 10-30mg/L〇
[0003] 乳過氧化物酶體系在食品行業中應用最廣泛的是乳制品，在過去幾十年里國內外 有大量從乳中提取LP的方法有色譜技術、膜色譜等，色譜技術應用有離子交換，分子篩，免 疫親和色譜，膜色譜應用較多的是離子交換吸附膜。雖然傳統這些色譜法提取LP純度較 高，但是仍有很多缺點例如耗時較長，回收率較低及成本昂貴，并不適宜大量生產乳過氧化 物酶。想要高效率的從牛乳清中提取LP并不是一個簡單的任務，因為乳清中存在大量的雜 蛋白給分離帶來了困難，因此從乳清中分離LP迫切的需要一個效率高、成本低、開發潛力 大的方法。
[0004] 鹽析沉淀法是酶分離純化過程中最常用的方法，其原理是在高濃度的鹽溶液中， 大量鹽離子使水濃度相對降低，蛋白質水化作用減弱，相互凝聚沉淀出來，由于蛋白質水化 作用與蛋白質本身的分子量、等電點等物化常數有關，所以不同蛋白質在不同鹽析條件下 的析出程度也不同，從而達到分離目的。鹽析法具有成本低、不需要昂貴設備、操作簡單安 全等特點，適用范圍十分廣泛。國內有關于用硫酸鹽析法分離大豆酸沉蛋白和羔羊皺胃酶 的報道，但是還沒有報道用其分離乳過氧化物酶的。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于克服上述現有技術缺陷，提供一種可以用于工業化生產高回收 率和純化倍數可用于食品工業的乳過氧化物酶提取方法。
[0006] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0007] 以牛乳清為原料，以硫酸銨鹽析法為提取手段，確定硫酸銨鹽析法中最佳鹽析條 件下飽和度、鹽析時間、最佳轉速、體系pH的工藝條件，并比較了硫酸銨鹽分級沉淀與直接 一次用65%硫酸銨飽和度對LP酶活回收率和純化倍數的影響。采用超濾技術進行進一步 純化，最后透析脫鹽和冷凍干燥制得成品，即原料乳清一硫酸銨鹽析法分級沉淀提取乳過 氧化酶一沉淀溶解一溶液使用超濾分離一收集截留溶液一透析脫鹽一冷凍干燥一乳過氧 化物酶粗產品。
[0008] 具體的，本發明的一種采用超濾法輔助硫酸銨鹽析提取乳過氧化物酶的方法，包 含以下步驟：
[0009] (1)硫酸銨鹽析法分級提取乳過氧化物酶：
[0010] 除去新鮮的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室溫條件下，向乳清中添加 25-85%飽和度的硫酸銨，離心，去除沉淀，置于攪拌器上不斷攪拌使硫酸銨充分溶解，調節 體系pH到5. 5-8. 5,放置2-10h使乳過氧化物酶完全沉淀，4°C5000-10000r/min離心20min 到沉淀即為乳過氧化物酶制品；
[0011] ⑵超濾：
[0012] 將步驟（1)中得到的沉淀使用適量去離子水復溶用超濾膜進行超濾分離，以除去 雜蛋白，收集截留溶液；
[0013] (3)脫鹽處理：
[0014] 將步驟（2)收集的截留溶液裝入透析袋內進行脫鹽；
[0015] (4)干燥：
[0016] 將步驟（3)脫鹽溶液冷凍干燥即制得乳過氧化物酶粗制品。
[0017] 在本發明中，優選的，所述步驟（1)中使用硫酸銨飽和度為65%。
[0018] 在本發明中，優選的，所述步驟（1)中使用硫酸銨分級沉淀鹽析，具體為使用先 用飽和度25-35%的硫酸銨鹽析，離心，去除沉淀，上清液中繼續加硫酸銨至終飽和度為 55-70 %〇
[0019] 在本發明中，優選的，所述步驟（1)中使用先用飽和度30%的硫酸銨鹽析，離心， 去除沉淀，上清液中繼續加硫酸銨至終飽和度為65%。
[0020] 在本發明中，優選的，所述步驟（1)中離心轉速使用7000r/min。
[0021] 在本發明中，優選的，所述步驟（1)中硫酸銨鹽析時間為8h。
[0022]在本發明中，優選的，所述步驟（1)鹽析體系pH為6. 5。
[0023] 在本發明中，優選的，所述步驟（2)中使用分子量30_50kDa的超濾膜進行超濾分 離，以除去部分分子量小于30_50kDa的雜蛋白，收集截留溶液，進而達到濃縮純化乳過氧 化物酶的目的。
[0024] 在本發明中，優選的，所述步驟（2)中超濾所使用的超濾膜的分子量為30kDa。
[0025] 在本發明中，優選的，所述步驟（3)中將步驟（2)收集的截留溶液裝入分子量 2-14kDa透析袋內進行脫鹽，每隔l-2h更換一次去離子水，透析3-4h即可。
[0026] 本發明與現有技術不同之處在于本發明取得了如下技術效果：
[0027] 采用本發明提取的乳過氧化物酶粗產品為淡黃色粉狀物，乳過氧化物酶的酶活回 收率和純化倍數分別達到79. 25-85. 21 %和4. 08-4. 58倍。
[0028] 通過上述提取工藝可以直接獲得回收率較高的乳過氧化物酶，可以直接制得天然 的抗菌介質乳過氧化物酶制品，也可以將其制品作為天然防腐劑直接加入到食品中。
[0029] 通過上述提取方法可以直接獲得回收率較高的乳過氧化物酶，可以直接制得天然 的抗菌介質乳過氧化物酶制品，也可以將其制品作為天然防腐劑直接加入到食品和牙膏等 曰用品中。
[0030] 下面結合附圖對本發明作進一步說明。
【附圖說明】
[0031] 圖1為SDS-PAGE電泳圖譜分析；
[0032] 注：泳道M為標準物質Marker圖譜，泳道1為乳清樣品，泳道2為二步鹽析后所得 的乳過氧化物酶，泳道3為二步鹽析并經過30kDa分子量超濾膜后的乳過氧化物酶；圖譜左 側的一列數字代表Marker的分子量（單位：kD);
[0033] 圖2為不同飽和度硫酸銨對LP分離效果的影響；
[0034] 注：同一曲線標注無相同字母者差異顯著（p〈0. 05);
[0035] 圖3為轉速對LP酶活回收率和純化倍數的影響；
[0036] 注：同一曲線標注無相同字母者差異顯著（p〈0. 05);
[0037] 圖4為鹽析時間對LP酶活回收率和純化倍數的影響；
[0038] 注：同一曲線標注無相同字母者差異顯著（p〈0. 05);
[0039] 圖5為鹽析體系pH對LP酶活回收率和純化倍數的影響；
[0040] 注：同一曲線標注無相同字母者差異顯著（p〈〇. 05);
[0041] 圖6硫酸銨鹽分級沉淀LP酶活回收率和純化倍數的影響；
[0042] 注：同一曲線標注無相同字母者差異顯著（p〈0. 05)。
【具體實施方式】
[0043] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員 應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0044] 實施例1乳過氧化物酶的提取
[0045] (1)硫酸銨鹽析法提取乳過氧化物酶：
[0046] 除去新鮮的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室溫條件下，向乳清中先添加 30%飽和度硫酸銨，離心，去除沉淀，上清液中繼續加硫酸銨至終飽和度為65 %，置于攪拌 器上不斷攪拌使硫酸銨充分溶解，調節體系pH到6. 5,放置8h使乳過氧化物酶完全沉淀， 4°C7000r/min離心20min到沉淀即為乳過氧化物酶制品，并計算其酶活回收率和純化倍 數；
[0047] (2)超濾：將步驟（1)中得到的沉淀進行溶解，溶解后得到的溶液置于分子量 30kDa的超濾膜，進行超濾分離，除去部分分子量小于30kDa的雜蛋白，收集超濾膜所得的 截留溶液，進而達到濃縮純化乳過氧化物酶的目的；
[0048] (3)脫鹽處理：將上述截留溶液裝入分子量10kDa透析袋內進行脫鹽，每隔l_2h 更換一次去離子水，透析3_4h;
[0049] (4)干燥：
[0050] 將脫鹽溶液冷凍干燥即制得乳過氧化物酶粗制品。
[0051] 結果驗證：
[0052] 1、SDS-PAGE電泳圖譜分析：
[0053] 蛋白標準品、牛乳清、二步鹽析后所得的乳過氧化物酶和二步鹽析并超濾后所得 的乳過氧化物酶的SDS-PAGE圖譜見圖1，由圖1可以看出牛乳清所在泳道處有很多條帶，即 含有多種蛋白質成分；硫酸銨鹽析結合超濾分離后的電泳條帶明顯減少，所獲得的條帶接 近報道的LP分子量為85kDa左右，這表明本發明的一種采用超濾法輔助硫酸銨鹽析提取乳 過氧化物酶的方法是分離乳過氧化物酶的有效方法。
[0054] 2、乳過氧化酶的酶活測定
[0055] 取3mL濃度為lmmol/L的ABTS(溶于0.lmol/LpH6. 0的磷酸鹽緩沖溶液）至反應 試管中，然后加入〇.lmL的濃度為3. 2mmol/L的H202，再加入適當稀釋的反應酶液0.lmL(用 0.lmol/LpH6. 0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋），充分混合后，開始計時，反應2min后立即測定 吸光度值，在波長為412nm處，以ABTS和適當稀釋酶液的混合液為空白對照組（在室溫條 件下）。LP的酶活力單位是U/mL，公式為：
[0056]酶活力=A A412XVXS/e XV1XDX2
[0057] 式中AA412為2min吸光度的變化，V為反應液的總體積，S為樣品酶液的稀釋倍 數，VI是樣品酶液的添加體積，D是光路徑為lcm，2代表時間是2min，e= 32. 4mmol/L、 cmx〇
[0058] 3、乳過氧化物酶的酶活性回收率和純化倍數的計算
[0060] 式中AR為LP的酶活回收率，Ls和Li分別代表鹽相溶液和乳清中LP酶活，Vs和 Vi分別代表鹽相溶液體積和乳清體積。
[0061] 結果表明采用本發明方法提取得到的乳過氧化物酶粗產品為乳白色粉狀物，乳過 氧化物