珠子參皂苷誘導干細胞分化肝細胞及治療肝病藥物的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及珠子參皂苷誘導干細胞分化肝細胞及治療肝 病藥物的應用。
【背景技術】
[0002] 我國由于乙型肝炎病毒感染率較高，感染者進而罹患急慢性肝炎、肝纖維化乃至 肝硬化、肝癌的事件屢見不鮮，肝臟疾病目前已經成為中國醫療衛生的主要負擔之一。肝臟 疾病進展到肝硬化等終末期肝病（end-stageliverdisease,ESLD)時，通常累及廣泛肝實 質細胞，肝組織再生能力下降，造成肝功能失代償并最終導致肝功能衰竭。常規的內科保肝 治療效果不佳，病死率很高。目前，原位肝移植術是治療ESLD最有效的方法，雖然近期療效 較好，但由于手術復雜、器官來源困難、費用高昂、免疫排斥反應及長期使用免疫抑制劑等 因素，使其臨床廣泛應用受到了一定的限制。近年來干細胞技術的發展為治療終末期肝病 帶來了新的希望。干細胞療法因其簡單易行，創傷小而成為關注的焦點。骨髓干細胞移植 在治療急慢性肝功能衰竭、終末期肝病及遺傳代謝性肝病等方面有了很大的進展，其在近 期療效、安全性、耐受性等方面獲得了肯定，且因其本身的優勢（如費用低廉、取材方便、不 存在免疫排斥反應等）而越來越受到重視。雖然肝移植是治療各種終末期肝病的有效方 法，但由于供肝來源不足、操作復雜、并發癥多、移植后免疫排斥及治療費用昂貴等原因， 限制了臨床肝移植的發展。因此，自開展干細胞研宄以來，骨髓干細胞（bonemarrowstem cells,BMSCs)移植為ESLD患者帶來了福音。
[0003] 干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的原始細胞。根據其生存階段可以分 為胚胎干細胞和BMSCs。胚胎干細胞具有全能性，可分化為體內所有的組織細胞，但是，干細 胞的定向分化是在細胞內外因素的共同作用下完成的，細胞_細胞間的相互作用及某些生 長因子可促使干細胞向某一方向分化，因此，在體內復雜的微環境中，很難確保其向單一方 向分化，研宄發現這種全能干細胞移植后有形成腫瘤（如畸胎瘤）的風險，同時又因為倫理 問題，限制了其在臨床上的發展應用。近年來許多科學家都先后證實BMSCs的分化能力是 最接近胚胎干細胞的成體干細胞，可以分化成為心、肝、腦、肌肉、軟骨、胰島等多種體細胞。 BMSCs因其來源豐富，自體移植可避免疫排斥反應，不涉及倫理等諸多優點而倍受關注，充 分開發利用BMSCs，將為心、肝、腦等重要器官致命性疾病的治療開辟一條新的道路。Jiang 等人研宄發現BMSCs可定向誘導分化為肝樣細胞，這種細胞具有正常肝細胞的形態和功能 特點，可合成白蛋白、甲胎蛋白、尿素等。雖然也有肝干細胞、臍血干細胞等應用于臨床治療 ESLD的報道。我國也早在20世紀中葉就已經開展中藥對BMSCs的生物學影響研宄，應用中 藥治療血液病、抗放化療副作用等取得了很好的臨床效果。
[0004] 珠子參（Panaxjaplcusvar,major)系五加科人參屬植物。別名扣子七、鈕子七、 竹鞭三七、疙瘩七、土三七、盤七、野三七等。民間習用其干燥根狀莖入藥。其味苦、甘，微寒， 歸肝、肺、胃經，具有補肺養陰、祛瘀止痛、止血等功效，主治氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、 關節痹痛、咳血、吐血、衄血、崩漏及外傷出血等。對其化學成分研宄表明，其主要化學成分 為皂苷類，分為齊墩果烷型、達瑪烷型、留類，包括珠子參皂苷K1和K2,竹節參苷、20-0-葡 萄糖基-人參皂苷Rf、人參皂苷R〇、人參皂苷Kd、Re、Rc、Rb、Rgl、Rb3、Rg2,人參皂苷F1~ F3、20(S)_假人參皂苷Fll、珠子參皂苷FI~F6、羽葉三七苷、三七苷Sap-3為0-谷甾 醇-3-0-0-D-吡喃葡萄糖苷。齊墩果酸-28-0-0-D-毗哺葡萄糖苷、齊墩果酸、谷甾 醇-3-0-D-毗喃葡萄糖苷、0 -谷留醇等；其次為多糖、倍半萜類以及人體必需微量元素Fe、 Cu、Zn、Mn、Ni、Co、Mo等。
[0005] 珠子參及其主要成分珠子參總皂苷具有較廣泛的藥理作用，對血液及造血系統、 消化系統、免疫系統、腫瘤、心血腦管系統等均有作用。我們研宄發現，珠子參有較顯著的抗 腫瘤活性，證實珠子參能扶持機體正氣，恢復或改善機體內環境的穩態，正向調節NK-IL-2 軸功能，并通過促胸腺細胞增生分化為成熟T細胞向外周釋放，進一步提高機體免疫調節 因子水平，促進抗腫瘤效應細胞的活性，以清除或抑制腫瘤的發生發展；能誘發人肝癌細胞 株SMMC27721產生典型的凋亡形態與超微結構變化；可使細胞阻滯在G0/G1期，從而阻止細 胞向S期轉換，干擾細胞周期進程，并顯著引起細胞凋亡，降低癌基因c-myc和c-fos表達， 增高抑癌基因P53和p21表達。
[0006]目前，雖有關于誘導干細胞分化成肝細胞的報道材料，但是針對珠子參皂苷誘導 干細胞分化肝細胞及治療肝病的應用方面的研宄還未見報道。珠子參對肝損傷具有良好 的療效，并證實珠子參皂苷能誘導BMSCs分化為肝細胞，但目前有關珠子參皂苷如何動員 BMSCs向受損肝臟募集、歸巢，如何改善病變肝細胞微環境，促進募集BMSCs的存活及分化 為肝樣細胞，從而修復受損肝臟，恢復受損肝臟功能的機制研宄還少有報道；我國是肝病大 國，肝硬化、肝癌和肝衰竭已成為眾多ESLD患者的最終歸宿。干細胞移植為治療終末期肝 病提供了新的希望，利用干細胞分化肝細胞的研宄也就成為現階段亟待解決的問題，而治 療肝病方面的藥物也有著廣泛的市場。
【發明內容】
[0007] 本發明的主要目的之一在于滿足市場需求，解決干細胞分化肝細胞難實現和肝病 難于治療的問題，從而提供珠子參皂苷的新用途，即珠子參皂苷誘導干細胞分化肝細胞及 治療肝病藥物的應用。
[0008] 本發明開發了珠子參皂苷的新用途，包括：利用珠子參皂苷誘導骨髓間充質干細 胞定向分化為肝細胞；利用珠子參皂苷研制治療肝病及中晚期肝癌的藥物。本發明還提供 了利用珠子參皂苷誘導骨髓間充質干細胞定向分化為肝細胞的實現方法。
[0009] 為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為：
[0010] 珠子參阜苷誘導干細胞分化肝細胞的應用，從珠子參中提取的珠子參阜苷在制備 誘導干細胞分化為肝細胞誘導劑中的應用。
[0011] 進一步的，珠子參皂苷誘導干細胞分化肝細胞的應用，所述干細胞為成體干細胞。
[0012] 進一步的，珠子參皂苷誘導干細胞分化肝細胞的應用，所述成體干細胞為骨髓間 充質干細胞。
[0013] 進一步的，珠子參皂苷誘導干細胞分化肝細胞的應用，所述干細胞分化為肝細胞 誘導液的主要成分包括珠子參皂苷、肝細胞生長因子（HGF)、骨細胞方向分化的誘導液。
[0014] 一種珠子參皂苷誘導干細胞分化肝細胞的應用方法：取大鼠骨髓間充質干細胞 進行傳代培養，取穩定的傳代的骨髓間充質干細胞于誘導培養基中進行誘導培養，獲得 成熟的肝細胞樣細胞；所述誘導培養基為添加有珠子參皂苷與細胞生長因子的基礎培養 基，所述基礎培養基中珠子參皂苷與細胞生長因子的添加量為：珠子參皂苷的濃度為： 50-200yg/mL，細胞生長因子（HGF)的濃度為：10-30ng/mL。
[0015] 優選的，所述基礎培養基中添加的細HGF的濃度為：20ng/mL。
[0016] 進一步的，珠子參皂苷誘導干細胞分化肝細胞的應用方法，取大鼠骨髓間充質干 細胞進行傳代培養，取第三代的骨髓間充質干細胞，接種于低糖DMEM培養基中，培養條件 為：，當所述骨髓間充質干細胞單層長到80%后，將所述骨髓間充質干細胞的培養基更換 為含有珠子參皂苷與細胞生長因子的誘導培養基中進行誘導培養，每3天換液1次，培養2 周后，獲得成熟的肝細胞樣細胞。
[0017] 一種誘導干細胞分化肝細胞的誘導劑，所述誘導劑含有珠子參或珠子參皂苷。
[0018] 一種珠子參皂苷在治療肝病中的應用，所述應用為珠子參皂苷在治療肝病中的藥 物組合物中的應用。
[0019] 一種治療肝病中的藥物組合物，所述治療肝病中的藥物組合物中含有珠子參皂 苷；所述藥物組合物的制劑形式包括：注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、 軟膏劑、控釋劑、緩釋劑或納米制劑。
[0020] 本發明的有益效果為：開發了珠子參皂苷的新用途：利用珠子參皂苷誘導骨髓間 充質干細胞體外定向分化為肝系細胞，分化穩定，效果好；將珠子參皂苷應用于治療肝病的 藥物中，進一步的明晰珠子參皂苷的藥理和藥效，為新藥的開發提供了基礎。
【附圖說明】
[0021] 圖1所示為骨髓間充質干細胞（BMSCs)細胞形態圖：A:染色前BMSCs細胞形態圖、 B:染色后BMSCs細胞形態圖；
[0022] 圖2為BMSCs細胞生長曲線；
[0023] 圖3珠子參皂苷誘導BMSCs分化后細胞形態圖：A:空白組、B:珠子參皂苷200yg/ mL組；
[0024] 圖4珠子參皂苷誘導BMSCs分化后細胞合成糖原的影響圖：A:空白組、B:珠子參 皂苷200yg/mL組；
[0025] 圖5珠子參皂苷誘導BMSCs分化7天后細胞AFP、Albumin、CK18蛋白表達的影響 圖：1 :空白組、2 :HGF組、3 :珠子參皂苷50yg/mL組、4 :珠子參皂苷100yg/mL組、5 :珠子 參皂苷200yg/mL組；
[0026] 圖6珠子參皂苷誘導BMSCs分化14天后細胞AFP、Albumin、CK18蛋白表達的影響 圖：1 :空白組、2 :HGF組、3 :珠子參皂苷50yg/mL組、4 :珠子參皂苷100yg/mL組、5 :珠子 參皂苷200yg/mL組；
[0027] 圖7珠子參皂苷對BMSCs在肝纖維化模型大鼠肝組織募集的影響圖；
[0028] 圖8珠子參皂苷及BMSCs移植對肝纖維化模型大鼠肝纖維化的HE染色影響圖：A: 正常組、B:模型組、C:BMSCs移植組、D:珠子參皂苷組、E:BMSCs移植+珠子參皂苷組；
[0029] 圖9珠子參皂苷及BMSCs移植對肝纖維化模型大鼠肝組織Nrf2蛋白表達的影響： 1 :正常組、2 :模型組、3 :BMSCs移植組、4 :珠子參皂苷組、5 :BMSCs移植+珠子參皂苷組。
【具體實施方式】
[0030] 下文將結合附圖詳細描述本發明的實施例。應當注意的是，下述實施例中描述的 技術特征或者技術特征的組合不應當被認為是孤立的，它們可以被