一種重組人骨形態發生蛋白-2的循環層析復性方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體屬于基因重組蛋白藥物領域，涉及一種重組人骨 形態發生蛋白-2的循環層析復性方法。
【背景技術】
[0002] 骨形態發生蛋白（BMP)是由骨基質分泌的一種疏水性蛋白，屬于轉化生長因子 (TGF- β )超家族成員，由Urist等人于1965年首次提出，1972年定義，并于1982年首次從 脫鈣骨基質提取物中分離得到的一種活性蛋白質。BMP家族包括BMP-I、2、4、6、7、9、12、14 等，其中BMP-2具有明顯誘導未分化成纖維細胞定向分化為成骨細胞的作用，并能調節成 骨細胞和成軟骨細胞的分化，誘導異位骨形成和促進骨折愈合的功能。BMP-2是骨生成的啟 動因子，可以加速骨的重建，是骨修復基因治療的理想目的基因，是目前唯一能誘導異位成 骨的細胞因子，因而成為骨組織工程學研宄中最重要的生長因子。目前，BMP-2已成功地用 于治療骨不連和骨缺損的修復。BMP -般無種屬特異性，具有跨種屬誘導成骨能力，因而其 臨床應用前景十分廣闊。
[0003] BMP-2可以通過天然牛骨提取純化和基因重組誘導表達后分離純化兩種方法制 備。其中天然提取法成本高，產率低，易失活，不適于工業化生產，逐漸被基因重組法代 替。大腸桿菌表達系統憑借技術成熟、表達量高、成本低等優點，成為目前基因重組法生產 BMP-2的一個熱點技術。然而，經大腸桿菌表達的BMP-2以無活性的包涵體形式存在于胞 內，如何將包涵體通過復性得到具有生物活性的BMP-2二聚體，是重組蛋白藥物研發生產 中的關鍵步驟。
[0004] 常用的BMP-2包涵體復性技術為稀釋復性和透析復性技術，例如國內研宄者姚少 華等于2005年研宄了重組BMP-2稀釋復性、透析復性工藝，并研宄了溶菌酶的羥基磷灰石 色譜復性工藝；孫奮勇等于2006年進行了重組BMP-2復性工藝研宄，采用稀釋復性工藝； 王馥麗等于2008年研宄了高濃度復性工藝，采用透析復性工藝進行復性。目前的復性工藝 存在著蛋白易沉淀復性率低、工藝路線煩瑣生產周期長、復性液消耗大成本高等問題，并不 適于工業規模化生產。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種重組人骨形態發生蛋白-2包涵體的復性方法。
[0006] 本發明提供的方法，包括如下步驟：
[0007] 1)變性重組人骨形態發生蛋白-2包涵體，得到變性后蛋白；
[0008] 2)對所述變性后蛋白進行親和層析復性，依次收集洗脫液，得到回收后層析復性 液、重組人骨形態發生蛋白-2單體、重組人骨形態發生蛋白-2二聚體和重組人骨形態發生 蛋白-2多聚體；
[0009] 3)變性所述重組人骨形態發生蛋白-2多聚體，得到重組人骨形態發生蛋白-2多 聚體變性后蛋白；
[0010] 4)對所述重組人骨形態發生蛋白-2多聚體變性后蛋白和所述重組人骨形態發生 蛋白-2單體進行再次親和層析復性，收集洗脫液，得到循環層析復性的重組人骨形態發生 蛋白-2二聚體；
[0011] 5)合并步驟2)得到的所述重組人骨形態發生蛋白-2二聚體和步驟4)得到的循 環層析復性的重組人骨形態發生蛋白-2二聚體，實現重組人骨形態發生蛋白_2包涵體的 復性。
[0012] 上述方法中，
[0013] 在步驟1)和步驟2)之間，還包括預純化的步驟：將所述變性后蛋白經陽離子交換 層析純化，收集洗脫緩沖液，得到預純化后變性蛋白。
[0014] 上述方法中，
[0015] 步驟2)包括如下步驟：
[0016] 2)_1)、將所述變性后蛋白上樣到親和層析柱，得到上樣后親和層析柱，再用層析 復性液流經所述上樣后親和層析柱，靜置復性；
[0017] 所述層析復性液由終濃度為0· lmol/L Tris-HCl、終濃度為0· 5mol/L尿素、終濃 度為0· lmol/L 2-環己氨基乙磺酸、終濃度為0· 2mol/L精氨酸、終濃度為0· 5mmol/L氧化 型谷胱甘肽、終濃度為lmmol/L還原型谷胱甘肽和水組成；
[0018] 2)-2,用洗脫緩沖液A對2)-1處理后的層析柱進行洗脫，收集洗脫液，得到回收后 層析復性液；所述洗脫液A為洗脫緩沖液FH-A ;
[0019] 2) -3,用洗脫緩沖液B對2) -2處理后的層析柱進行洗脫，收集洗脫液，得到重組人 骨形態發生蛋白-2單體；所述洗脫液B為由體積分數75 %的平衡緩沖液FH-A和體積分數 25%的洗脫緩沖液FH-B-I組成的混合液；
[0020] 2) -4,用洗脫緩沖液C對2) -3處理后的層析柱進行洗脫，收集洗脫液，得到重組人 骨形態發生蛋白-2二聚體；所述洗脫液C為由體積分數55 %平衡緩沖液FH-A和體積分數 為45%的洗脫緩沖液FH-B-2組成的混合液；
[0021] 2) -5,用洗脫緩沖液D對2) -4處理后的層析柱進行洗脫，收集洗脫液，得到重組人 骨形態發生蛋白-2多聚體；所述洗脫緩沖液D為洗脫緩沖液FH-B-3 ;
[0022] 所述洗脫緩沖液FH-A由終濃度為50mmol/L Tris-HCl、終濃度為3mol/L尿素和水 組成；
[0023] 所述洗脫緩沖液FH-B-3由終濃度為50mmol/L Tris-HCl、終濃度為3mol/L尿素、 終濃度為lmol/L NaCl和水組成；
[0024] 所述洗脫緩沖液FH-B-2為將所述洗脫緩沖液FH-B-3中的NaCl終濃度調節為 0.45mol/L得到的溶液；
[0025] 所述洗脫緩沖液FH-B-I為將所述洗脫緩沖液FH-B-3中的NaCl終濃度調節為 0. 25mol/L得到的溶液。
[0026] 上述方法中，
[0027] 所述2) -2,所述收集洗脫液為收集0. 8個柱體積的洗脫液；所述洗脫的時間為25 分鐘
[0028] 所述2) -3,所述收集洗脫液為收集3個柱體積的洗脫液；所述洗脫的時間為70分 鐘，
[0029] 所述2) -4,所述收集洗脫液為收集I. 5個柱體積的洗脫液；所述洗脫的時間為38 分鐘，
[0030] 所述2) -5,所述收集洗脫液為收集1. 5個柱體積的洗脫液；所述洗脫的時間為25 分鐘。
[0031] 上述方法中，
[0032] 步驟4)包括如下步驟：
[0033] 4)_1 :將所述重組人骨形態發生蛋白-2多聚體變性后蛋白和所述重組人骨形態 發生蛋白-2單體上樣親和層析柱，得到上樣后親和層析柱，再將所述回收層析復性液流經 所述上樣后層析柱，靜置復性；
[0034] 4)_2:用所述洗脫緩沖液B洗滌4)_1)處理后的層析柱；所述洗滌流速為 80±20ml/min ；
[0035] 4) -3 :用所述洗脫緩沖液C洗脫4) -2)處理后的層析柱，收集洗脫液，得到循環層 析復性的重組人骨形態發生蛋白-2二聚體。
[0036] 上述方法中，
[0037] 4) -3中，所述收集洗脫液為收集0. 8個柱體積的洗脫液，所述洗脫的時間為20分 鐘。
[0038] 上述方法中，
[0039] 所述親和層析柱的柱床體積1L，柱內徑100mm、填充介質肝素瓊脂糖（Heparin Sepharose)；
[0040] 所述靜置復性的溫度為4攝氏度、時間為4天；
[0041] 所述親和層析中每步洗脫的流速均為80±20ml/min。
[0042] 上述方法中，
[0043] 所述預純化中，所述將所述變性后蛋白經陽離子交換層析純化為將所述變性后蛋 白流經陽離子交換層析柱，再用洗脫緩沖液洗脫，收集1個柱體積的洗脫液，得到預純化變 性蛋白；
[0044] 所述洗脫緩沖液為由體積分數25 %的平衡緩沖液SP-A和體積分數75 %的洗脫緩 沖液SP-B組成的混合液；
[0045] 所述平衡緩沖液SP-A由終濃度為50mmol/L磷酸二氫鈉、終濃度為8mol/L尿素和 水組成；
[0046] 所述洗脫緩沖液SP-B由終濃度為50mmol/L磷酸二氫鈉、終