一種利用保守區肽段組合來檢測特異性抗體的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種利用保守區肽段組合來檢測特異性抗體的方法，屬于生物技術和 特異性抗體檢測領域。
【背景技術】
[0002] 特異性抗體的檢測在醫學、生物學等領域的研宄中，甚至臨床應用中均占有重要 地位。其目的主要是協助臨床診斷，在某些疾病中及預后的一個指標，在傳染病流行病學調 查中，特異性抗體的檢測也具有特殊的、重要的意義。
[0003] 針對特異性抗體檢測方法的研宄已相對成熟。傳統方法有沉淀反應、凝集試驗、補 體結合試驗等，而現在醫學、生物學研宄中更為常見的有酶聯免疫吸附法（ELISA)、放射免 疫測定、熒光免疫測定、發光免疫測定等標記免疫測定方法。各類特異性抗體的檢測方法擁 有一個通用原理，即抗原與抗體的特異性結合。
[0004] 然而病毒、細菌等常見抗原的基因相當復雜多變。遺傳多樣性，即生物的遺傳基因 多樣性，是生命進化和物種分化的基礎，主要是指生物種內基因的變化，包括同一種群內或 不同的種群之間的遺傳變異。自然界中，種群內的個體之間往往沒有完全一致的基因型。微 生物作為生物圈不可或缺的重要組成部分，擁有豐富的遺傳多樣性，尤其是野生型病毒、細 菌的基因型，更為復雜。近年來，隨著藥物的濫用、各類疫苗的普及、環境的污染、機體免疫 力普遍下降等諸多因素的共同影響，病毒和細菌變異株的出現頻率逐漸升高。二者直接導 致病毒型抗原和細菌表面抗原的復雜多變，這種現狀加大了使用抗原有效檢測特異性抗體 的難度。
[0005] 目前醫學、生物學研宄領域及臨床應用中，通常采用單一抗原進行特異性抗體的 檢測，由于突變株的增生，加上抗原本身就具有多種基因型，甚至基因亞型（尤其某些突變 頻繁的流行性病毒），特異性抗體的檢測時常會出現檢測信號波動的情況。
[0006] 比如使用商業診斷試劑盒檢測乙肝病毒表面抗原（HBsAg)時，個別基因型的樣本 或變異株可能由于結合的特異性不足，首次檢測信號與再次檢測信號出現很大差異。為滿 足各基因型樣本的檢測需求，有學者提出，可在抗體檢測前，先將樣本進行分類，再有針對 性的選擇對應抗原進行檢測，但此舉將大大增加樣本檢測的金錢成本和時間成本，臨床應 用可行性不足。又如檢測梅毒抗體時，ELISA檢測試劑盒采用單一梅毒螺旋體（TP)外膜脂 蛋白作為抗原進行檢測，但基因重組的TP抗原僅具有一級結構，與天然抗原存在差異，有 文獻報道，陰性樣本的復檢與初檢結果只有19. 3%的符合率。種種跡象表明，使用單一抗原 檢測特異性抗體已經無法滿足臨床需求。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是面對某些抗原復雜多變的情況，或者抗原突變株增生的現狀，在 傳統單一抗原無法有效檢測出特異性抗體的前提下，提供一種檢測特異性抗體的新方法。 傳統觀念里，當抗原種類較復雜時，在使用單一抗原檢測特異性抗體前，為了提高檢測特異 性，需針對待測樣品所感染的抗原進行分類，再選擇適合的抗原進行特異性抗體的檢測，本 發明可節省這一復雜的步驟，并提高檢測結果的穩定性。
[0008] 本發明的第一個目的是提供一種利用保守區肽段組合來檢測特異性抗體的方法。
[0009] 所述方法包括以下步驟：
[0010] (1)確定用于檢測的抗原具有相對保守的氨基酸序列（序列間差異以不超過20% 為佳）；
[0011] (2)在相對保守的氨基酸序列中篩選出2-5條可覆蓋90%以上目標檢測人群的肽 段；
[0012] (3)當篩選的肽段長度小于50個氨基酸或由于其他原因造成肽段的免疫原性過 低時，采用偶聯大蛋白的方式提高其免疫原性；將篩選的肽段組合起來，作為檢測使用的抗 原；
[0013] (4)用上一步得到的抗原檢測樣本中的特異性抗體。
[0014] 所述肽段組合是指將篩選的肽段分別偶聯大蛋白，然后將偶聯后的復合物混合， 作為檢測抗原。
[0015] 所述步驟（4)中的檢測，可以是任一常規抗體檢測手段，比如ELISA。
[0016] 所述方法，在本發明的一種實施方式中，是用來檢測抗乙型肝炎病毒前SI抗體。
[0017] 所述方法，在本發明的一種實施方式中，包括：
[0018] (1)確定抗乙型肝炎病毒前Sl抗體的P94序列相對保守；
[0019] (2)獲取乙肝患者血樣，擴增其血清中病毒DNA的前Sl區域并進行測序，將各樣本 的測序結果翻譯為氨基酸序列后，分別與已報道的乙肝病毒P94肽段序列進行比對分析， 確定患者感染的P94基因型，從而篩選獲得2條以上可覆蓋90%以上目標檢測人群的肽段 (即90%的目標檢測人群，含有篩選得到的肽段的任意一條）；
[0020] (3)將上一步篩選得到的肽段分別偶聯大蛋白，然后將偶聯后的復合物混合，作為 抗原；
[0021] (4)用上一步得到的抗原檢測血清中的P94抗體。
[0022] 所述步驟（2)篩選得到的肽段，在本發明的一種實施方式中，必須包括序列為SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2 的肽段。
[0023] 所述步驟（2)篩選得到的肽段，在本發明的一種實施方式中，還可以包括表1中除 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2序列以外的其他任意1-3種肽段。
[0024] 所述步驟（3)中的大蛋白，在本發明的一種實施方式中，可以是KLH、0VA、BSA。
[0025] 所述步驟（4)中的檢測，在本發明的一種實施方式中，是將混合后的偶聯的復合 物作為ELISA包被抗原，采用ELISA法檢測抗體。
[0026] 本發明的第二個目的是提供一種用于檢測抗乙型肝炎病毒抗體的組合抗原，該組 合抗原包含序列為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的肽段。
[0027] 所述組合抗原，在本發明的一種實施方式中，還包括表1中除SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2序列以外的其他任意1-3種肽段。
[0028] 所述組合抗原，在本發明的一種實施方式中，是將序列為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的肽段分別偶聯大蛋白后，將偶聯后的復合物混合得到的。
[0029] 本發明還要求保護所述組合抗原在檢測抗乙型肝炎病毒抗體方面的應用，以及含 有所述組合抗原的試劑盒。
[0030] 本發明的有益效果：（1)本發明是從單一表位，根據基因型的不同，從保守區肽段 篩選獲得能夠覆蓋大部分目標的肽段，通過保守區肽段組合來檢測特異性抗體；本發明的 保守區肽段組合的方法不僅可代替單一抗原檢測特異性抗體，而且具有可重復性高、數據 穩定性高等優點，可以克服目前單一抗原檢測所存在的準確性低、穩定性低的缺陷；（2)本 發明創造性地采用保守區肽段，保守區肽段
[0031] 的突變相對較少，序列簡單，臨床應用的可行性較高；而且保守區肽段通常較短，
[0032] 便于人工合成，同時易于組合檢測；（3)保守區肽段組合，相對單一抗原檢測而
[0033] 言，可擴大檢測群體的適用范圍；(4)保守區肽段與所屬物種（如病毒）的發展
[0034] 進化、生命周期、感染途徑等有關，對應的特異性抗體檢測意義顯著。
【附圖說明】
[0035] 圖I :202例測序成功樣本提供者感染的P94基因型分布圖；
[0036] 圖2 :批間變異系數對比圖；其中a為變異系數柱狀圖；b為單一包被B基因型
[0037] P94肽段檢測P94抗體時的變異系數散點圖；c為單一包被C基因型P94肽
[0038] 段檢測P94抗體時的變異系數散點圖；d為組合包被B+C基因型P94肽段
[0039] 檢測P94抗體時的變異系數散點圖。
【具體實施方式】
[0040] 通過多基因型肽段組合的方式檢測抗乙型肝炎病毒前Sl (94-117)抗體（簡
[0041] 稱P94抗體）來具體說明本發明方法。
[0042] 實施例1 :相對保守氨基酸序列的確定和分析
[0043] 乙肝病毒基因型分為A-H，共8種，其前Sl (94-117)氨基酸序列相對保
[0044] 守，但有所不同。通過分析從NIH的基因銀行（GenBank)獲取的39個已報道
[0045] 的乙肝病毒基因亞型序列，發現乙肝病毒基因亞型的P94肽段平均有5-10%的
[0046] 差異，極端情況20% (表1)，如Cl和Hl之間（5/24)。而使用單一前Sl (94-117)
[0047] 多肽（簡稱P94肽段）作為包被抗原來檢測非相應抗體時，由于存在較多非特異
[0048] 性識別，信號必將出現波動。現有檢測乙肝病毒表面抗原（HBsAg)的商業診斷
[0049] 試劑盒也說明了類似問題：在檢測變異株的HBsAg時，可能由于結合的特異性
[0050] 不足，而導致信號波動（如首次檢測信號較低不能確定，而再次檢測時出現高水
[0051] 平信號）。
[0052] 表1不同乙肝病毒基因型的P94肽段序列
[0053]
[0055] 注：表中加粗斜體，為同種基因型內細分基因型比較后的差別。
[0056] 結合實際情況（已驗證P94序列相對保守），本發明的檢測P94抗體的方法
[0057] 為：①確定2個可覆蓋大部分患者群（90%以上）的相對保守的P94肽段；②將
[0058] 篩選出的P94肽段組進行優化（通過偶聯KLH大蛋白提高P94肽段的免疫原性）；
[0059] ③將優化后的P94肽段組合起來作為ELISA包被抗原；④檢測患者血清中的P94
[0060] 抗體。
[0061] 實施例2 :可覆蓋大部分患者群的相對保守的肽段的篩選
[0062] 具體實施步驟如下：
[0063] 步驟一：提取慢性乙肝患者血清中的病毒DNA
[0064] 獲取慢性乙肝患者血樣213例，血樣提供者年齡跨度較大（7歲-73歲），男性占 61% (130/213) 〇
[0065] 使用 TAKARA 公司的 DNA 提取試劑盒（MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5. 0, Catalog No. 9766)，對213例樣本進行病毒基因提取，將提取的乙肝病毒DNA作為 模板鏈進行PCR擴增。
[0066] 步驟二：PCR擴增病毒前Sl區域并進行測序
[0067] 通過PCR分別對213例DNA樣本進行DNA模板鏈的擴增，同時設置進行對照品（未 添加 DNA模板的空白組），反應體系均為50 μ L，各試劑加入量詳見表2。
[0068] 為提高產物純度，采用巢式PCR進行擴增，使用的引物序列見表3。
[0069] 第一輪PCR反應程序設置為95°C預變性3min，95°C變性40sec，55°C退火30sec， 72°C鏈延長40sec，72°C穩定3min，共進行36個循環。第二輪PCR反應程序設置為95°C預 變性 3min，95°C變性 40sec，50°C 退火 30sec，72°C 鏈延長 40sec，72°C穩定 3min，共進行 36 個循環。擴增產物使用I. 2%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。
[0070] 213例DNA提取樣品中，一次擴增不成功的樣品將進行第二次擴增，以排除PCR實 驗誤差。若兩次擴增均未成功（相應位置沒有呈現條帶），則認為該樣品的DNA提取步驟未 成功。
[0071] PCR擴增結果為：202例DNA提取樣品擴增成功；11例樣品擴增失敗。
[0072] 表