一種具有多靶點的抗菌多肽偶聯物及其二聚物的合成和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物化學領域，涉及一種具有多靶點的抗菌多肽偶聯物；本發明同時 還涉及該抗菌肽在制備抗菌藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 在人類發展的長河中，細菌感染曾經奪去無數人的生命。自從青霉素問世以來，大 量的抗菌藥物不斷涌現，在細菌感染疾病的治療中發揮了極大的作用。但是由于抗菌藥物 的不合理應用，導致細菌耐藥頻繁發生，甚至耐藥傾向性產生的速度遠遠超出抗菌藥物的 研發速度。細菌耐藥性已經成為全球嚴重的公共衛生問題。特別是"超級細菌"的出現，使 人類面臨無藥可用的窘境。因此除了規范抗菌藥物的使用外，迫切需要開發具有新作用機 制并且不受傳統耐藥機制影響的抗菌藥物。
[0003] 吖啶分子是一個多芳香環化合物，其能夠通過插入到DNA中而誘導細胞死亡。 目前，已經有多種吖啶類似物被合成，并用于抗細菌、抗瘧疾甚至是抗腫瘤研宄[Acta poloniae pharmaceutica, 2012;69:3]。早在 1912 年，Ehrlich 和 Benda 就把卩丫啶分子運 用于抗菌領域。而在1917年，基于吖啶分子的抗菌藥物便成功地上到臨床研宄[Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2001 ;47:1]。但是，此后由于青霉素的興起，占據了抗菌藥 的主要市場，叮啶類藥物就逐漸的離開了人們的視線。但是近些年，由于耐藥性細菌的廣 泛發生，卩丫啶類藥物又引起了人們的廣泛關注[The Open Medicinal Chemistry Journal, 2011;5:11]。
[0004] 核定位序列（NLS，PKKKRKV)是一段有7個氨基酸殘基組成的多肽片段，NLS作為 病毒SV40的T抗原的一個片段，因其具有轉運細胞外活性物質進入細胞核的能力而為人們 所熟知[Advanced Drug Delivery Reviews, 2007;59:698]。研宄發現，盡管作用機制不 清楚，但是NLS對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都表現出一定的抑制作用[Antimicrobial agents and chemotherapy, 2006;50:1118]〇
[0005] 迄今發現的抗生素基本上都是通過單一作用機制抑殺細菌，這就很容易導致細菌 對這類藥物產生耐藥性。因此發展具有多靶點的抗生素藥物對于治療耐藥細菌感染具有重 要意義。另外，由于具有多個作用靶點，細菌也不容易對這類藥物產生耐藥性。
【發明內容】
[0006] 為了發展不易受傳統耐藥機制影響的抗菌藥物，針對現有技術中存在的問題， 本發明的一個目的是提供一種具有多靶點的多肽偶聯物抗菌藥物Acr3-NLS及其二聚物 (Acr3-NLS)2; 本發明的另一個目的是提供了具有多靶點的多肽偶聯物抗菌藥物Acr3-NLS及其二聚 物（Acr3-NLS)2的合成方法； 本發明還提供一種以抗菌多肽偶聯物為活性成分在制備抗菌藥物中的應用。
[0007] -、具有多靶點的抗菌多肽偶聯物及其合成 1、具有多靶點的抗菌多肽偶聯物的結構 本發明具有多靶點的抗菌多肽偶聯物，是基于吖啶分子Acr和核定位序列NLS構建的 具抗菌多肽偶聯物Acr3-NLS,其結構序列如下：
其中所用氨基酸都為L型氨基酸，P為脯氨酸，K為賴氨酸，R為精氨酸，V為纈氨酸，C 為半胱氨酸。
[0008] 2、具有多靶點的抗菌多肽偶聯物的合成 本發明具有多靶點的抗菌多肽偶聯物的合成，是在具有正電荷多肽序列Pro-Lys-Lys- Lys-Arg-Lys-Val-Cys-NHj^ N端引入側鏈含有吖啶基團的賴氨酸（Lys (acridine))。其具 體合成步驟如下： (1) 含有吖啶基團氨基酸Fmoc-Lys (Acr)的合成 a. 9-Phenoxyacridine的合成：氬氣保護下，使苯|^、Na0H、9-氯卩丫啶以10:1. 5:1的摩 爾比，于95~105°C反應I. 5~2h，加入NaOH溶液終止反應；然后在室溫下靜置10~12h，得到 黃色沉淀；過濾，水洗，抽干，即得產物9-Phenoxyacridine ; b· Fmoc-Lys (Acr)的合成：氬氣保護下，使 Fmoc-Lys-〇H、苯酷、9-phenoxyacrudine 以1:12:2的摩爾比，于55~65°C反應~5h;用無水乙醚隨沉淀，過濾，洗滌，即得產物 Fmoc-Lys(Acr)； (2) Acr3-NLS的固相合成： a. 樹脂預處理：將Rink-Amide-MBHA樹脂加入到二氯甲烷中攪拌，使樹脂充分溶脹后 減壓抽干溶劑； b. 脫Fmoc保護：將預處理的樹脂加入到脫保護試劑中，攪拌2min后抽干，重復使 Fmoc基團完全脫除，然后用DMF洗滌除凈脫保護試劑；所述脫保護試劑為哌啶與DMF以 1:4~1:5體積比的混合物； c. 縮合：氬氣保護下，將Fmoc保護氨基酸、N-羥基苯并三氮唑、0-苯并三氮 唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲-六氟磷酸鹽溶于DMF中，再加入二異丙基乙胺后混勻，然后加入 脫Fmoc保護的樹脂進行攪拌反應；通過茚檢試劑檢測反應程度，待反應完全后用DMF重復 洗滌除去未反應的試劑；所述氨基酸、N-羥基苯并三氮唑、0-苯并三氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四 甲基脲-六氟磷酸鹽、二異丙基乙胺的摩爾比為1: 1:1:2 ;氨基酸與脫Fmoc保護的樹脂的 摩爾比為3:1~4:1 ; d. 肽鏈的延長：重復b和c兩個過程，按照設計要求將L型氨基酸脯氨酸，賴氨酸，精 氨酸，繳氨酸，半胱氨酸及Fmoc-Lys (Acr)連接到樹脂上，直至接肽完成為止； e. 肽鏈從樹脂上的切割：按照步驟b的方法將最后一個連接的氨基酸的Fmoc基團 完全脫除；用DCM、MeOH交替洗滌樹脂，充分抽干溶劑后，加入切割劑，于室溫下切割反應 1. 5~3小時，收集切割試劑并減壓旋干，用乙醚進行震蕩沉淀，靜置后先去除上清的乙醚，再 用水充分溶解后用分液漏斗除去乙醚相；水相經冷凍干燥，得白色固體粉末粗肽；所述切 割劑是由三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、1，2-乙二硫醚、水以82. 5:5:5:2. 5:5體積比的混混合 物；切割劑的加入量為每克肽樹脂加入10~25mL ; f.粗肽的脫鹽和純化：以體積濃度1〇~20%的乙酸溶液為流動相，將粗肽通過 Sephadex G25交聯葡聚糖凝膠柱脫鹽，利用紫外檢測儀收集主峰后冷凍干燥，得到脫鹽的 肽化合物；再利用反向高效液相色譜柱進行分離純化，收集主峰，冷凍干燥，得到白色的純 肽固體粉末即為Acr3-NLS產品。
[0009] 上述方法制備的產物經質譜和色譜分析檢測，與設計的化合物結構一致。表明成 功合成了 Acr3-NLS。Acr3-NLS的理化特征見表1。
[0010] 二、多肽偶聯物抗菌藥物二聚物（Acr3-NLS)2及其合成 1、二聚物（Acr3-NLS)2的結構 本發明多肽偶聯物抗菌藥物二聚物（Acr3-NLS)2，是將兩個多肽偶聯物抗菌藥物 Acr3-NLS分子通過二硫鍵相連形成的二聚物（Acr3-NLS)2。其結構式如下：
其中所用氨基酸都為L型氨基酸，P為脯氨酸，K為賴氨酸，R為精氨酸，V為纈氨酸，C 為半胱氨酸。
[0011] 2、二聚物（Acr3-NLS)2的合成 (1)抗菌肽Acr3-NLS序列中半胱氨酸側鏈巰基的活化：將二硫二吡啶溶于甲醇溶液中， 將具有多靶點的抗菌多肽偶聯物Acr3-NLS溶于甲醇/水中，并加入上述二硫二吡啶的甲醇 溶液中，反應1〇~16 h，利用C18反相高效液相柱層析純化，得到巰基活化的Acr3-NLS ;二硫 二吡啶與具有多靶點的抗菌多肽偶聯物Acr3-NLS的摩爾比為10:1~15:1。
[0012] (2 )抗菌多肽二聚物的合成：將巰基活化的Acr3-NLS與純化的Acr3-NLS以 1:1. 2~1:1. 6的摩爾比溶于甲醇/水中，反應10~16 h，通過HPLC進行純化，得到二聚物 (Acr3-NLS)2O
[0013] 上述甲醇/水中，甲醇與水的體積比為1:1~1:10。
[0014] 上述方法制備的產物經質譜和色譜分析檢測，與設計的化合物結構一致，表明成 功合成了 Acr3-NLS二聚物（Acr3-NLS)2。二聚物（Acr 3-NLS)