免疫抑制細胞及其制造和使用方法
【專利說明】免疫抑制細胞及其制造和使用方法
【相關申請】
[0001]本申請要求申請日為2012年6月4日的美國臨時申請N0.61/655，191的優先權，該申請的全部內容以引用方式全部合并于此。
【先前技術】
[0002]髓源性抑制細胞(MDSCs)是一群包含有早期髓系前驅細胞/粒細胞異質群體、巨噬細胞和樹突狀細胞等異細胞亞群的集合體。這些細胞通常由髓系標記Gr-1和CDllb表現其特征。髓源性抑制細胞由于可藉由增加免疫抑制因子，例如精氨酸酶I(ARG-1)和一氧化氮合酶2(N0S2)之表現來抑制T細胞效應之功能，而在腫瘤免疫逃逸機制、自體免疫疾病、移植排斥反應，慢性炎癥及感染等方面扮演重要角色。參見(例如)，Gabrilovich與Nagaraj, Nat Rev Tmmunol 9:162-174(2009)。
[0003]由于髓源性抑制細胞所具有之免疫抑制特性，而使其能做為治療免疫性疾病的候選藥物。因此，亟需一種藉由得自活體培養方式產生之穩定且安全的髓源性抑制細胞。
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【發明內容】
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[0004]本發明基于此發現，生長調節致癌基因(GRO)趨化激素，尤其是GRO-γ，對于人類周邊血單核細胞衍生的樹突狀細胞(MDDCs)之分化及功能具有抑制作用。此外，發現GRO-y可驅動MDDCs分化成為一種類似髓源性抑制細胞(MDSC)的表現型。
[0005]因此，本發明所描述系關于一種獲得免疫抑制細胞的方法。該方法包括:獲得一種能分化成樹突狀細胞之前驅細胞；及將該前驅細胞培養于含有一趨化激素之培養基中一段足夠使該前驅細胞分化為樹突狀細胞的時間，其中該樹突狀細胞系呈現一種免疫抑制表型，而藉此獲得該免疫抑制細胞。所述之趨化激素可為一種GRO趨化激素，例如，GRO-γ或GRO- α。
[0006]另一方面，本發明包含一種藉由上述方法得到之免疫抑制細胞，及含有該細胞的組成物。
[0007]本發明亦描述一種使用上述細胞或細胞組成物治療個體中各種病況之方法。例如，本發明之細胞或細胞組成物可用于有需要之個體中抑制免疫反應，調節與腫瘤發生相關之血管新生，治療自身免疫疾病，治療發炎性疾病，或治療移植物對抗宿主疾病(GVHD)。
【圖式簡單說明】
[0008]圖1表示間葉系干細胞(MSC)-條件培養基對于MDDC分化產生了抑制效果。將純化來自人類PBMCS的⑶14+單核細胞培養在有或無MSC-條件培養基(MSC-CM) (1/2Χ體積)存在下培養于DC-分化培養基中。于第5天iDC再經無或以LPS(lmg/mL)處理(mDC)兩天。于第7天分析MDDCs的表型和功能。㈧針對與DC成熟相關之表面標記進行染色，并以流式細胞儀分析，測定10，000個細胞的平均熒光強度(MFI)。(B)未成熟之MDDCs以熒光標記葡聚糖試劑(lmg/mL)于37°C下施予脈沖30分鐘，并藉由以流式細胞儀測量之FITC-葡聚醣攝取量分析其內吞能力。所顯示于FITC-葡聚醣攝入后之FACS圖譜為:無FTIC-葡聚醣存在下的MDDCs作為陰性對照組(NC，灰線)，iMDDCs (iDC,虛線)，及有MSC-CM存在下之iMDDCs具(iDC+MSC-CM，黑色實線)。數據為于2位供者進行之三次獨立實驗的代表性結果。(C)成熟MDDCs與同種異體之T細胞共培養4天(DC:T = 1:10)，并于以I μ Ci/孔之[3H]-胸苷施予脈沖16小時后測量定與胸苷的并入量。藉由于三名供者各重復三次所測得之[3H]-胸苷并入量來測定T細胞增生。數據以相對于無MSC-CM補充組之倍數(MFI 土 SD)，或以[3H]-胸苷攝取量之CPM(平均值土SD)表示。數據代表三次獨立實驗之結果。(η =3 位供者，每次實驗)ο *:ρ<0.05 ;林:p<0.01 ;***:ρ<0.0001ο
[0009]圖2表示MSC-CM對MDDCs的抑制效果可藉由將抗-GRO- γ中和抗體加入MSC-CM而產生逆轉。(A)使用市售之人類細胞激素/趨化激素抗體數組(RayB1)比較得自MSC條件培養基(MSC-CM)與含血清培養基對照組的細胞激素圖譜。培養基中所含細胞激素和趨化激素的量，系藉由將所述之數組膜先與對抗特定細胞激素或趨化激素之生物素標記的抗體，之后再與HRP-共軛的卵白素進行培養，然后將其以X-射線底片曝光而測定得。實驗重復2次。(B)以流式細胞儀分析GRO趨化激素及IL-8對于未成熟MDDCs上之⑶40之表現的影響。將人類⑶14+單核細胞于IL-4(80ng/mL)和GM-CSF(80ng/mL)存在下，在含有10%人類AB+血清之a-MEM培養基中進行分化。于第7天，將⑶14 +單核細胞、單獨之未成熟MDDCs或補充以GRO- a、GRO- β、GRO- γ或IL-8之未成熟MDDCs進行針對CD40表現之染色，并以流式細胞儀分析。灰線對應未染色的對照組。所示數據為對應所指定趨化激素之⑶40陽性細胞的百分比。實驗結果來自三個獨立實驗。(C)以抗-GRO-γ (10 μ g/mL)抗體或同種型匹配的對照抗體于37 °C下培養60分鐘，將MSC-CM中的GRO- γ活性中和，之后放置于4°C下隔夜。將MDDCs在有或不含MSC-CM(1/2X體積)之DC分化培養基中，于有或無中和性抗-GRO-γ抗體存在下進行分化。利用流式細胞儀進行MDDCs表型分析，結果以平均熒光強度相對于未經處理之iDC(MFI土SD)所獲得數值的倍數表示。結果來自兩個實驗，每組包括兩名供者。*:ρ〈0.05 ;林:p<0.0lo
[0010]圖3顯示GRO- γ抑制MDDCs的分化。純化自人類PBMCs之⑶14+單核細胞于有或無重組GRO-γ (250ng/mL)存在下，經過或未經CXCR2受體競爭型拮抗劑SB225002 (250nm)預處理30分鐘的條件下進行分化。于第7天，分析MDDCs的表型和功能。(A)經過表面標記標定后，使用流式細胞儀進行MDDCs的表型分析。條形圖代表相對于未經處理之iDCS所獲得之MFI的MFI倍數(MFI ± SD之倍數)。數據相當于三個獨立實驗之平均值，其中每個實驗包括兩至三名供者。(B)在37°C下，將未成熟之MDDCs以FITC-葡聚醣(lmg/mL)施予脈沖30分鐘，并以流式細胞儀測定其攝取情形。數據系來自五個不同實驗，且以相對于iDC組之MFIiSD的倍數表示。η = 2-3。(C)將成熟MDDCs與同種異體T細胞(DC:T = 1:10)共培養4天，并于以I μ Ci/孔之[3H]-胸苷施予16小時-脈沖后胸苷與測定胸苷并入量。以[3H]-胸苷并入量來測定T細胞增生。數據以相對于未經處理之MMDCs之CPM(平均值土SD)的倍數表示，且數據系來自五個獨立的實驗。η = 2-3ο *:ρ<0.05:ρ<0.01 ;***:ρ〈0.0OOl0
[0011]圖4顯示于GRO-γ存在下分化的MDDCs具有細胞激素耐受性。將純化自人類PBMCs之⑶14+單核細胞于有或無重組GRO-γ (250ng/mL)存在下，經過或未經CXCR2受體競爭型拮抗劑SB225002 (250nm)預處理30分鐘的條件下進行分化。(A)以實時RT-PCR測定培養7天之MDDCs的mRNA表現。將Ct值以GAPDH基因之表現量為基準歸一化。以2_Λ ct法計算差異值，且數據以相對于未經處理之DC所獲得之值的百分比表示。結果代表得自五個獨立的實驗重復三次的平均值±標準偏差。*:p<0.05 ;林:p<0.01:ρ<0.0001ο (B)培養液中的細胞激素含量以ELISA進行測定。數據系以相對于未經處理DC所獲得之值(平均值土SD)的細胞激素濃度倍數。η = 2-3ο數據來自至少三個獨立的實驗。*:ρ<0.05 ;林:p〈0.01 ;***:ρ〈0.0OOl0 (C)將進行分化5天之未成熟MDDCs固定于載玻片上，并以0.1 %(v/v)NP-40/PBS使其具有可通透性。藉由將MDDCs以小鼠抗-人類IDO抗體(1/50)，及之后之山羊抗-小鼠IgG-DyLight 488標記的抗體(1/150)進行染色，來檢測細胞內的IDO表現。通過共聚焦顯微鏡采集影像。線段=10μπι。
[0012]圖5顯示受GRO- γ處理之MDDCs啟動的T細胞具有耐受性性質。將人類⑶3+Τ細胞(3X 15個)以被3X 10 4個于有或無重組GRO-γ存在下，經過或未經SB225002預處理之條件下進行分化之MDDCs刺激。(A)以RT-PCR評估于純化自MDDC的CD3+T細胞及T細胞共培養物中之選擇性基因IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA表現。相對基因表現系對于GAPDH之表現正常化。數據以相對于經DC-啟動之T細胞組所得值(平均值土SD)的基因表現倍數表示(η = 3)。實驗結果來自5個獨立實驗。(B)以ELISA分析存在于收集自與T淋巴細胞共培養之經GRO- γ處理和未處理的MDDCs之細胞培養上清中的細胞激素圖譜。數據以細胞因子濃度的平均值土標準偏差表示。η = 2-3。結果來自三個獨立實驗。*:ρ〈0.05:ρ〈0.01 ;***:ρ〈0.0001。
[0013]圖6顯示GRO-γ處理之BMDC呈現MDSC細胞之細胞圖譜。(A)自C57BL/6小鼠采集骨髓細胞，并以單獨GM-CSF、GM-CSF/GR0- γ或GM-CSF/GR0- γ /SB225002處理六天使其分化為BMDCs。以FACS分析使用抗⑶Ilb和GR-1抗體進行純化自BMDCs表面標定。然后使用FACS Aria細胞分選儀分離⑶I Ib和GR-1雙陽性細胞，并以RT-PCR測定精氨酸酶I和誘導型一氧化氮合酶基因的轉錄程度。mRNA的表現系以BMDCs相對mRNA倍數表現(對GAPDH基因表現量正常化)。數據取自三次測量平均值土標準偏差(η = 3)。結果來自三次獨立實驗。(B)以FACS Aria分選出OT-1/⑶8+Τ細胞，并于0VA257-264勝肽存在下與經GRO- γ處理或未經處理的BMDC共培養3天。使用3H-胸苷并入分析來測定抗原特定刺激之T細胞增生。(C)為于活體內分析GRO-處理細胞之免疫抑制活性的實驗流程圖。步驟1:BMDCs免疫前六天，準備不同組衍生自C57BL/6小鼠骨髓細胞的BMDCs。步驟2和步驟3:BMDCs免疫前一天將C57BL/6小鼠以IGy照射，然后將小鼠以靜脈注射OT-1脾臟細胞(4 X 17細胞/鼠)。第4步:收集各種不同的BMDCs (5X 14細胞/小鼠)，然后于第O天以皮下注射到6-8周齡之OT-1脾臟細胞-重建的B6小鼠。步驟5:BMDCs刺激后第7天，犧牲各實驗組小鼠并從各小鼠收集脾臟細胞，然后置于96孔U底平盤中以0VA(1 μ g/mL)或對照組勝肽RAH(1 μ g/mL)刺激。以3H-胸腺嘧啶核苷并入法測定脾臟細胞的增生活性(步驟6)。(D)收集來自經過或未經GRO-γ處理之C57BL/6小鼠骨髓細胞的BMDCs，并以0VA257_264勝肽施予脈沖。待使用清洗緩沖液除去未結合的勝肽后，將不同的BMDCs制備物再懸浮于150 yL的PBS中，然后以皮下注射入以OT-1脾臟細胞(4 X 17細胞/小鼠)重建之于受照射的C57BL/6小鼠中。于BMDCs投藥后第7