間皮素抗體和引起有效的抗腫瘤活性的方法
【專利說明】
[0001] 交叉引用相關申請
[0002] 本申請要求2012年9月27日提交的美國臨時申請號61/706, 396的權益，在此整 體引入該申請的內容。
技術領域
[0003] 本公開涉及單克隆抗體，如特異于間皮素的單域的單克隆抗體。本公開進一步涉 及該抗體的使用，如用于癌癥的診斷和治療。
【背景技術】
[0004] 由于間皮素在惡性間皮瘤中高度表達（Chang等，Cancer Res 52 :181_186,1992 ; Chang和 Pastan，proc Natl Acad Sci USA 93:136_140，1996)以及在其它實體腫瘤，如胃 癌、鱗狀細胞癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、膽管癌、乳腺癌和卵巢癌癥中高度表達，因此間皮 素被認為是一個治療靶點。（Hassan 等，Clin. Cancer Res. 10 :3937-3942, 2004 ;McGuire 等，N. Engl. J. Med. 334 :1-6,1996 ;Argani 等，Clin. Cancer Res. 7 :3862-3868,2001 ; Hassan 等，Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 13 :243-247,2005 ;Li 等，Mol. Cancer Ther. 7 :286_296, 2008 ;Yu 等，J Cancer I : 141-1749, 2010 ;Tchou 等，Breast Cancer Res Treat 133(2) :799-804, 2012;美國專利號 7, 081，518)。
[0005] 間皮素（MSLN)基因編碼~70kDa的前體蛋白，該蛋白被加工形成~30kDa N 端蛋白和~40kDa的C端膜結合成熟間皮素（Hassan和Ho, Eur J Cancer 44:46-53， 2008)。在過去近20年里，開發了許多抗間皮素的單克隆抗體（mAb)，包括SSlP免疫毒素 和M0RAb-009 (也稱阿麥妥昔單抗（Amatuximab))，該抗體目前在進行針對于間皮瘤和其它 癌癥的臨床試驗的評估（Hassan 和 Ho，Eur J Cancer 44 :46_53, 2008 ;Ho，Biodrugs 25 : 275-284,2011)。SSlP是重組的免疫毒素，由與截短的假單胞菌外毒素融合的小鼠的抗間 皮素 Fv 組成，其介導細胞殺傷（Pastan 和 Hassan，Nat Rev Cancer 6:559-565, 2006)。關 于SSlP的聯合化療的臨床試驗目前正在進行。基于小鼠 SSlFv的嵌合（鼠/人）抗體 M0RAb-009在具有間皮素的腫瘤細胞上引起抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用（ADCC) (Hassan 等，Cancer Immure 7:20, 2007)。
[0006] 最近美國國家癌癥研宄所（NCI)的研宄人員制備了兩個完全人源的識別間皮素 的單克隆抗體（m912 和 HN1) (Feng 等，Mol Cancer Ther 8 :1113-1118, 2009 ;Ho 等，Int J Cancer 128 :2020-2030, 2011)。自噬菌體展示庫分離HNl人源Fv，并且生成完全人源化 IgG。通過將HNl Fv融合到截短的假單胞菌外毒素 A(PE38)而產生HNl的免疫毒素 （Ho 等，Int J Cancer 128:2020-2030,2011)。HNl的IgG結合于與細胞表面相關聯的間皮素 并且通過非常強的ADCC來對腫瘤細胞進行殺傷。HNl人源抗體識別重疊間皮素中的SSl 位點的構象表位，其表明HNl可以開發成基于SSl的單克隆抗體的完全人源化版本（如 M0RAb-009)。雖然已知的許多間皮素單克隆抗體都是可用的，但是沒有一個可以展現出針 對于腫瘤細胞的補體依賴性細胞毒性（CDC)。因此，目前靶向間皮素的治療由于缺乏具有強 效的CDC的抗間皮素的單克隆抗體而被阻礙。
[0007] ⑶C是治療性抗體的重要的細胞殺傷機制（Weiner等，Nat Rev Immunol 10 : 317-327, 2010)。第一個被批準的癌癥治療的單克隆抗體，利妥昔單抗，對于其抗腫瘤活 性，部分依賴于CD C。在臨床前的研宄中，它的抗腫瘤活性在CI q缺失的小鼠中完全喪 失（abolished) (Di Gaetano 等，J Tmmunol 171 :1581-1587, 2003)。在 B 細胞淋巴瘤的 異種移植模型中補體的耗盡也降低其活性（Cragg和Glennie，Blood 103:2738-2743， 2004)。目前認為當結合于位點的抗體靠近細胞膜時CDC才可能發生（Pawluczkowycz等， J Immunol 183 :749_758, 2009)。作為這一解釋的依據，奧法木單抗（ofatumumab)，其比利 妥昔抗體更靠近細胞膜進行結合，而其⑶C的活性也更高（Pawluczkowycz等，J Immunol 183 :749-758, 2009)。幾乎所有現有的間皮素單克隆抗體和免疫毒素（包括HNl和SSlP/ M0RAb-009)識別I區域，細胞表面的間皮素的N末端被推測為遠離細胞膜（Kaneko等，J Biol Chem 284:3739-3749,2009)。
【發明內容】
[0008] 本發明公開了間皮素特異性人源單域（VH)抗體（簡稱為SDl和SD2)。SDl抗體結 合在人的間皮素的C末端的構象表位，并且對于表達間皮素的腫瘤細胞展現出很強的CDC 活性以及ADCC。SD2特異于全長的人的間皮素，但不能結合間皮素的C末端間皮素肽。
[0009] 本發明提供的是包含SDl或SD2的一個或者多個（諸如所有的三個）⑶R的單克 隆抗體。本發明提供的抗體包括免疫球蛋白分子，例如IgG抗體，以及抗體片段和單域（VH) 抗體。進一步提供組合物，所述組合物包含結合（例如特異性結合）于間皮素的抗體、編碼 這些抗體的核酸分子、包括所述核酸分子的表達載體、以及表達所述核酸分子的分離的宿 主細胞。本發明還提供了免疫偶聯物，所述免疫偶聯物包含本文所公開的抗體和效應分子 (例如毒素）。也提供了包含所述抗體的融合蛋白，例如包含人的Fc的融合蛋白。
[0010] 在此提供的抗體和組合物可用于各種目的，例如用于確定表達間皮素的癌癥的 診斷，所述癌癥諸如為間皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鱗狀細胞癌、胰腺癌、膽管癌、乳腺癌 (如三陰性乳腺癌）或卵巢癌。因此，在此提供了在受試對象中確定癌癥的診斷的方法，所 述確定癌癥的診斷通過使來自于被診斷為癌癥的受試對象的樣本與結合間皮素的單克隆 抗體進行接觸，并檢測所述樣本與所述抗體的結合來進行。根據所述抗體與所述樣本的結 合相對于所述所述抗體與對照樣本的結合的增加來確定癌癥的診斷。在一些實施方案中， 該方法進一步的包括使特異性識別所述特異性間皮素抗體的第二抗體與所述樣本接觸，以 及檢測所述第二抗體的結合。
[0011] 同樣地，在此提供了在受試對象中檢測表達間皮素的癌癥的方法。這一方法包括 使來自于受試對象的樣本與本文所描述的單克隆抗體接觸，以及檢測所述抗體與所述樣本 的結合。所述抗體與所述樣本的結合相對對照樣本的增加檢測受試對象的癌癥。在一些實 施方案中，該方法可以進一步包括使特異性識別所述特異性間皮素抗體的第二抗體與所述 樣本接觸，以及檢測所述第二抗體的結合。
[0012] 本發明進一步提供對于具有表達間皮素的癌癥的受試對象的治療方法，所述癌癥 例如為間皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鱗狀細胞癌、胰腺癌、膽管癌、乳腺癌（如三陰性乳腺 癌）或卵巢癌，該方法通過以下來進行：選定患有表達間皮素的癌癥的受試對象，并向受試 對象施用治療有效量的間皮素特異性單克隆抗體或者包含所述抗體的免疫偶聯物、融合蛋 白或組合物。
[0013] 本發明還提供了在受試對象中抑制腫瘤生長和抑制表達間皮素的癌癥的轉移的 方法，該方法通過選定患有表達間皮素的癌癥的受試對象，并向該受試對象施用治療有效 量的本文所公開的抗體、免疫偶聯物、融合蛋白或組合物。
[0014] 通過下面參考附圖的詳細描述，本發明上述的和其它的目標、特征以及優點將變 得更加清晰。
【附圖說明】
[0015] 圖1A-1D :對應間皮素 C末端的人單域抗體的生成。（圖1A)用于通過噬菌體展 示技術篩選人源抗體的肽的設計。提出了在膜結合間皮素中的三個功能區區：296-390 ; II區：391-486 ;111區487-598 (SEQ ID NO :9)。指示在細胞表面間皮素上的三個預測的N 連接聚糖（Asn388、Asn488和Asn515)。用于目前研宄的肽含有在間皮素 C末端的50個殘 基（SEQ ID NO :9的殘基539-588)。（圖1B)工程化的人源抗體結構域（VH)噬菌體展示 庫用于針對C末端間皮素肽（殘基539-588)的四輪噬菌體篩選。（圖1C)單克隆噬菌體 ELISA試驗在第四輪篩選結束時被執行。選擇SDl噬菌體克隆（克隆1)用于進一步分析， 因為其對全長間皮素和C末端多肽兩者均以強的信號進行結合。（圖1D)采用兩個所選的 抗體噬菌體克隆（SD1和SD2)執行單克隆噬菌體ELISA試驗。SDl克隆既結合全長人間皮 素（MSLN)又結合所述間皮素肽。而SD2克隆僅結合MSLN，不結合所述肽。
[0016] 圖2A-2B :SD1人源SDl Fc融合蛋白的制備和分析。（圖2A)非還原和還原條件下 的純化的SDl-hFC蛋白（每一泳道4 μ g蛋白）的SDS-PAGE分析。SDl-hFc蛋白的純度大 于95%。NR:非還原；R:還原。（圖2B)A431/H9(在表皮樣癌A431細胞系中的間皮素的強 制表達）（Ho 等，Clin Cancer Res 11 :3814-3820,2005)、NCI-H226(間皮瘤）和 KMBC(膽 管癌）的細胞提取物中的內源性間皮素蛋白的免疫沉淀。SDl被用于免疫沉淀細胞裂解物 中的內源性間皮素蛋白。C :無關的VH單域人源Fc融合體（fusion) ;IP :免疫沉淀；輸入： 免疫沉淀之前的全細胞裂解物上的蛋白質印跡。
[0017] 圖3A-3D :SDl-hFc的結合特性。（圖3A)直接ELISA。SDl-hFc與全長的人間皮 素蛋白（MSLN)和肽結合，但不結合小鼠的間皮素（mMSLN)或BSA。（圖3B)競爭性ELISA。 間皮素肽而不是SS1P、HN1或者含有50個殘基的無關肽，和人的間皮素蛋白競爭與SDl-hFc 結合。（圖3C)關于人的間皮素蛋白，SDl-hFc解離平衡Kd是13. 58nM，而對于所述肽是 16. 08nM (圖 3D)。
[0018] 圖4 :對表達間皮素的癌細胞和對照癌細胞上的SDl-hFc蛋白的流式細胞術分析。 SDl-hFc結合于穩定的間皮素 cDNA轉染的A431/H9細胞系上，不結合A431細胞系。所述抗 體也結合目前研宄中所測試的四分之三的人類癌癥細胞系。0VCAR8 :卵巢癌；NCI-H226 :間 皮瘤；EKVX 和 L55 :NSCLC ;KMBC，Mz-ChA-I 和 HuCCTl :膽管癌。
[0019] 圖5A-5H :對表達間皮素的癌細胞，SDl-hFc引發CDC和ADCC。（圖5A，5B)CDC檢 測試驗。在作為補體來源的正常的人血清（NHS，20% v/v)的存在下，將A431/H9(圖5A)和 NCI-H226(圖5B)細胞與增加的濃度的SDl-hFc -起培養（incubated)。在SDl-hFC存在 下，補體蛋白Clq結合H9(圖5C)和NCI-H226(圖5D)細胞，而在HNl或對照hFc融合蛋白 存在的條件下不結合。（圖5E-5H)ADCC檢測試驗。在增加濃度的SDl-hFc的存在下，剛分 離的外周血單核細胞（PBMC)以50 : 1的比例與靶細胞A431/H9(圖5E)或NCI-H226(圖 5F)細胞一起進行培養。以不同的E : T比，將純化的人的NK細胞與靶細胞A431/H9(圖 5G)或NCI-H226 (圖5H)，與50 μ g/ml SDl-hFc -起進行培養。通過LDH檢測確定CDC和 ADCC 活性（*:p < 0· 05)。
[0020] 圖6A-6D :SDl-hFc對腫瘤生長具有強抗腫瘤作用。（圖6A)將A431/H9細胞接 種在裸鼠脅腹以形成大約7〇mm3大小的腫瘤。從第7天起，每隔一天用SDl-hFc (50mg/kg) 或者PBS處理小鼠。向下的箭頭表示注射的日子。在第7-20天計算每一處理組的平均腫 瘤尺寸（％P < 0. 05)。（圖6B)在作為小鼠補體的來源的正常小鼠血清（30% v/v)的存 在下，將A431/H9細胞與100 μ g/mL SDl-hFc -起培養。通過LDH檢測測定⑶C活性（％p < 0. 05)。（圖6C)在作為小鼠效應細胞的來源的純化的小鼠 NK細胞的存在下，將A431/H9 細胞與100 μ g/mL SDl-hFc -起培養。通過LDH檢測測定小鼠 ADCC活性（*:p < 0. 05)。 (圖6D)鼠 NK細胞的純度。
[0021] 圖7Α-7Β :基于SDl的重組免疫毒素的制備和分析。（圖7Α)在非還原條件下的純 化的SD1-PE38(每一泳道4yg蛋白）的SDS-PAGE分析。SD1-PE38的純度大于95%。IT :免 疫毒素。（圖7B)利用WST-8檢測以SD1-PE38免疫毒素處理后的A431/H9、A431、NCI-H226 和KMBC細胞。
[0022] 序列表
[0023] 通過使用標準字母縮寫表示核苷酸堿基，以及使用三字母代碼表示氨基酸，而示 出列于所附的序列表中的核酸和氨基酸序列，如37C.F.R. 1.822中定義。每個核酸序列只 有一條鏈被表示，而互補鏈被理解為通過任意參照所顯示的鏈而被包括。序列表以2013年 9月11日創建的、大小26. 7KB的ASCII文本文件的形式提交，在此通過參考引入該文本。 在所附序列表中：
[0024] SEQ ID NO :1是SDl單域抗體的核苷酸序列。
[0025] SEQ ID NO :2是SDl單域抗體的氨基酸序列。
[0026] SEQ ID NO :3是假單胞菌外毒素（PE)的氨基酸序列。
[0027] SEQ ID NO :4是PE38的氨基酸序列。
[0028] SEQ ID NO :5是PE-LR的氨基酸序列。
[0029] SEQ ID NO :6 是 PE-LR/6X 的氨基酸序列。
[0030] SEQ ID NO :7是具有降低的免疫原性的PE的氨基酸序列。
[0031] SEQ ID NO :8 是 PE-LR/8M 的氨基酸序列。
[0032] SEQ ID NO :9是人的間皮素的氨基酸序列。
[0033] SEQ ID NOs :10-13 是引物序列。
[0034] SEQ ID NO : 14是SD2單域抗體的核苷酸序列。
[0035] SEQ ID NO : 15是SD2單域抗體的氨基酸序列。
【具體實施方式】
[0036] I.縮寫
[0037] ADCC抗體依賴的細胞介導的細胞毒性
[0038] CAR嵌合抗原受體
[0039] ⑶C補體依賴的細胞毒性
[0040] cDNA 互補的 DNA
[0041] ⑶R互補決定區
[0042] CTL細胞毒性T淋巴細胞
[0043] ELISA酶聯免疫吸附試驗
[0044] EM效應分子
[0045] FACS熒光激活細胞分選
[0046] GPI糖基化磷脂酰肌醇
[0047] hFc 人的 Fc
[0048] HRP辣根過氧化物酶
[0049] Ig免疫球蛋白
[0050] i. V.靜脈注射
[0051] Kd解離常數
[0052] LDH乳酸脫氫酶
[0053] mAb單克隆抗體
[0054] MAC膜攻擊復合物
[0055] mMSLN小鼠間皮素
[0056] MSLN 間皮素
[0057] NHS正常人血清
[0058] PBMC外周血單核細胞
[0059] PCR聚合酶鏈式反應 [0060] PE假單胞菌外毒素
[0061] PE藻紅蛋白
[0062] pfu空斑形成單位
[0063] RIPA放射免疫沉淀試驗
[0064] VH可變重
[0065] VL可變輕
[0066] II.術語和方法
[0067] 除非另有說明，技術術語以常規用法使用。分子生物學中常用術語的定義可以 在以下中找到：Benjamin Lewin，Genes V，Oxford University Press 出版，1994(ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew等（編），The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers(編），Molecular Biology and Biotechnology ：a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. 出版，1995 (ISBN 1-56081-569-8)。
[0068] 為便于理解本公開的各實施方案，下面提供了對特定術語的解釋：
[0069] 抗體：包含至少輕鏈或重鏈免疫球蛋白的可變區的多肽配體，其識別和結合（如 特異地識別和特異性結合）抗原表位，如間皮素、或其片段。免疫球蛋白分子由重鏈和輕鏈 組成，其中所述重鏈和輕鏈各自具有可變區，所述可變區稱為可變重（Vh)區和可變輕（') 區。Vh區和I區兩者一起負責結合抗體所識別的抗原。
[0070] 抗體包括完整的免疫球蛋白以及本領域公知的抗體的變體和部分，如單域抗體 (例如VH結構域抗體）、Fab片段、Fab'片段、F(ab)' 2片段、單鏈Fv蛋白（"scFv"）、和 二硫化物穩定的Fv蛋白（"dsFv"）。scFv蛋白是融合蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可變 區和免疫球蛋白的重鏈可變區通過連接基團而結合，而在dsFvs中，這些鏈發生了突變，并 引入二硫鍵來穩定鏈的結合（association)。術語"抗體"還包括基因工程形式如嵌合抗 體（例如，人源化鼠抗體）和異源偶聯抗體（如雙特異性抗體）。也參見Pierce Catalog and Handbook，1994-1995(Pierce Chemical Co. , Rockford,IL) ；Kuby,J. , Immunology,3rd Ed.，W. H. Freeman&Co.，New York，1997。
[0071] 通常情況下，天然存在的免疫球蛋白具有通過二硫鍵而相互連接的重（H)鏈和輕 (L)鏈。有兩種類型的輕鏈，Lambda(A)和KappaO )。主要有五個確定抗體分子的功能 活性的重鏈類（或同種型）：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE
[0072] 每個重鏈和輕鏈包含恒定區和可變區，（該區也被稱為"域")。在組合中，重鏈和輕 鏈可變區特異性結合抗原。輕、重鏈可變區包含被三個高變區間隔開的"骨架（framework) " 區域，所述高變區也被稱為"互補決定區"或"CDR"。根據Kabat等（見Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Health andHuman Services，1991)和 ImMunoGeneTics 數據庫（IMGT)(見 Lefranc，Nucleic Acids Res 29 : 207-9, 2001)限定骨架區和⑶R的范圍。IMGT和Kabat數據庫可在線使用。不同的輕鏈或 重鏈骨架區的序列在物種內（比如人類）是相對保守的。抗體的骨架區，即組成的輕鏈和 重鏈的結合骨架區，用于在三維空間定位和對齊CDR。
[0073] ⑶R主要負責結合抗原表位。每個鏈的⑶R通常被稱為⑶R1、⑶R2和⑶R3,從 N-末端開始順序編號，并且通常由特定⑶R所位于的鏈來識別。因此，Vh OTR3 (或H-⑶R3) 是位于其所被發現的抗體的重鏈的可變域，而'CDRl (或L-CDR1)則是來自其所被發現的 抗體的輕鏈的可變域。以結合間皮素的抗體為例，其具有特異性Vh區和V l區序列，并因此 具有特異性的CDR序列。具有不同的特異性（即，對不同抗原的不同結合位點）的抗體有 不同的CDR。雖然不同的抗體，其CDR是不同的，但在CDR內僅有有限數目的氨基酸位置直 接參與抗原結合。CDR內的這些位置被稱為特異性決定殘基（SDR)。
[0074] 引用"VH"或"VH"指的是免疫球蛋白的重鏈（包括Fv、scFv、dsFv或Fab的重鏈） 的可變區。引用"八"或"VL"指的是免疫球蛋白的輕鏈（包括Fv、scFv、dsFv或Fab的輕 鏈）的可變區。
[0075] "單克隆抗體"是由B淋巴細胞的單一克隆或由單一抗體的輕鏈和/或重鏈基因所 轉染到的細胞所產生的抗體。單克隆抗體通過本領域技術人員已知的方法來制備，例如通 過制備來自骨髓瘤細胞與免疫脾細胞的融合的雜交抗體形成細胞來制備。單克隆抗體包括 人源化單克隆抗體。
[0076] "嵌合抗體"包含來自兩種或多于兩種的不同抗體分子的結構元素，所述不同的抗 體分子通常來源于不同動物物種。例如，嵌合抗體可以具有來自于一種物種（比如人類） 的骨架殘基，以及來自其它物種（如特異性結合間皮素的小鼠抗體）的CDR(其通常賦予抗 原結合性）。
[0077] "人"的抗體（也被稱為"全人源"抗體）包括人骨架區和來自于人的免疫球蛋白 的所有的CDR。在一個實例中，所述骨架區和CDR來自相同起源的人重鏈和/或輕鏈的氨基 酸序列。然而，來自于一個人抗體的骨架可以被設計成含有來自不同的人抗體的CDR。"人 源化"的免疫球蛋白是含有人骨架區和一個或多個來自于非人（例如，小鼠、兔、大鼠、或合 成的）免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人類免疫球蛋白被稱為"供體"，而 提供骨架的人的免疫球蛋白被稱為"受體"。在一個實施例中，在人源化的免疫球蛋白中， 全部CDR是來自于供體免疫球蛋白。恒定區無需存在，但如果它們存在，它們必須與人免疫 球蛋白恒定區基本相同，即，至少約85-90 %，如95 %或更多是相